猪博卡病毒的研究概况

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（乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063）

猪博卡病毒的研究概况

蔡扩军，陈发喜，李爱巧，杨启元，韩 涌，李建玲，范玉娟

（乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063）

博卡病毒是近几年被发现的一种人、猪、牛、犬、猩猩等多种哺乳动物共患的新型DNA病毒，本文概述了博卡病毒的生物学特性，从流行病学的角度介绍了猪博卡病在国内外流行情况及对猪博卡病毒的检测方法，为猪博卡病毒的深入研究、防控及做好公共卫生安全提供参考。

猪；博卡病毒；研究概况；公共卫生；流行病学

猪博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）是2009年一种新发现的DNA病毒，该病原体的临床致病机制至今未得到证实，但多篇报道表明PBoV可能与仔猪腹泻病症的发生存在一定关系[1]。自2011年以来，我国大部分地区猪场的哺乳仔猪发生腹泻，而且反复发作，抗菌药防治和疫苗免疫效果均比较差，发病率和死亡率较高，疑似为新的病毒病感染[2-3]。有研究认为是猪流行性腹泻病毒变异毒株所致，同时有些科研单位用分子生物学方法对采集的发病猪的小肠或腹泻物进行检测，发现PBoV在不同地区具有不同的阳性率，但未能确定引起本次猪腹泻疫情的主要病原以及PBoV在其中承担的角色。乌鲁木齐市通过猪的流行病调查，发现病种以腹泻病症为主，其中哺乳仔猪的腹泻最为严重，其发病率和死亡率平均分别为9.49%和3.37%。因此，深入研究PBoV对于该病的防控不仅在新疆而且在全国具有重要意义，本文从多个方面对PBoV进行了概述。

1 病毒的发现及命名

2005年，瑞典科研工作者在患有下呼吸道疾病的瑞典儿童体内首次发现人博卡病毒[4]。2009年，瑞典科学家又利用宿主DNA清除、随机多重置换扩增方法（random multiple displacement amplifi cation，MDA）在患仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的猪淋巴结中检测到博卡病毒，通过测序发现其基因序列与人类博卡病毒相近，故将其归类到细小病毒亚科、博卡病毒属，命名为猪博卡样病毒[5]。随后，通过对其接近全长的基因组进行扩增和测序，进一步证明了该病毒属于博卡病毒属，与犬博卡病毒的亲缘关系较近，因此正式命名为猪博卡病毒（PBoV）[6]。2010年，Kapoor等从患有急性肠炎的大猩猩体内分离鉴定出了一种新的博卡病毒[7]。随后各国科研工作者陆续从断奶多系统衰竭综合征、高热病、具有腹泻症状和临床健康猪群中检测到PBoV。

2 分子生物学特性

博卡病毒是细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的新成员。博卡病毒属包括牛细小病毒、人类博卡病毒、犬微小病毒、大猩猩博卡病毒和猪博卡病毒。通过对PBoV全长基因组的测序与序列分析，发现我国所流行的PBoV与瑞典的毒株具有非常高同源性，基因序列与犬小病毒的亲缘关系更近，而与猪细小病毒的基因组同源性仅为52%～53%。

博卡病毒是单股线状无囊膜DNA病毒，电镜观察发现其体积很小，呈正二十面体结构，直 径 大 小 为25nm～30nm[8]。 根 据NCBI Gen-Bank报 道，PBoV基 因 组 全 长4756bp（Gen-Bank：KF206157.1）-5292bp（GenBank：KC473563.1），能自动利用内部回文序列对DNA基因组进行复制[7]。已确定有3个开放性阅读框，ORF1在5′末端，编码非结构蛋白NS1，该结构在病毒基因组的复制过程中起到非常重要作用[9]。ORF3在基因组的中间，编码磷酸化的非结构蛋白NP1，是博卡病毒的特征结构。ORF2编码重叠的结构蛋白VP1和VP2，研究表明该结构蛋白具有典型依赖钙离子的分泌性憐脂酶A2活性，对于病毒DNA从吞噬体进入细胞核这一过程起到关键性作用[10-11]（图1）。在不用报道中博卡病毒利用不同的基因区域（NS1，VP1，NP1）做系统分析的基因分型不相同，造成新的博卡病毒难以和以前发现的相区别[12]。依据病毒分类国际委员会（ICTV）标准，只要非结构基因的遗传同源性小于95%的种类即可被确定为博卡病毒属中的一个新种类，按照此标准，PBoV可分为超过5种类型（PBoV1～PBoV5）。建立在VP1和VP2部分基因上的PBoV（PBoV1）首次在瑞典感染PMWS猪中发现；接着在2010年，1型和2型PBoV全基因组被报道[13]；以选择的VP1基因片段进行系统分析的3型和4型两种新型PBoV在香港被报道[14]；5型PBoV的整个基因组在一头具有腹泻临床症状仔猪的粪便中被发现和报道[15]。

研究发现，博卡病毒的非结构蛋白NS1较为保守，而VP1和VP2两个衣壳蛋白较易发生突变，这提示不稳定结构的基因突变可能是导致新种群产生的重要原因，也可能是该病毒逃逸机体免疫监视的重要机制，提示稳定的NS1基因则可能成为制备疫苗和药物作用的靶位点[16]。

图1 PBoV的基因结构模式图

3 流行病学

3.1 国外流行情况

PBoV在美国、瑞典、罗马尼亚、匈牙利、北爱尔兰等国家均有感染发生。2009年，Blomstrom A L等使用PCR方法对瑞典58头猪的样品进行了猪圆环病毒2型（PCV2）、PBoV和输血传播肝炎病毒（TTV）检测，其中34头小猪患 PMWS，24头未患 PMWS，检测结果发现患PMWS病猪中TTV-1、TTV-2、PBoV和PCV2的感染率分别为77%、94%、88%和100%，而未患PMWS的猪群阳性率分别为79%、83%、46%和80%，这表明，患PMWS猪群往往引起多种病毒的混合感染，但是PBoV在PMWS发病过程承担的角色还需要进一步研究[5]。罗马尼亚Cadar D等分别对2006年和2010年采集的842头野猪样品进行PBoV的检测，发现PBoV阳性率从9.14%提高到了17.74%，其中6-12月龄野猪的阳性率为77.06%，12～36月龄野猪的阳性率为22.94%，分析结果表明低年龄段猪群对PBoV更易感[24]。2011年，McKillen J等对北爱尔兰采集的369份猪血清用间接免疫荧光法进行检测，发现PBoV3和PBoV4阳性率分别为8.7%和9.5%，他们还利用细胞培养技术在患PMWS病猪的粪便中分离到PBoV3和PBoV4，对其基因组序列进行测序，长度分别为5082bp和4125bp[8]。Zhai S 的通过研究发现具有呼吸道症状的猪群中猪博卡样病毒的阳性率为38.7%，而健康猪群的阳性率仅为7.3%，二者差异显著，因此他们认为猪博卡样病毒可能是导致猪呼吸道疾病的一个新病毒[6]。

3.2 国内流行情况

2009年，翟少伦等对我国部分省市猪场的191份临床样品进行检测，结果显示75份为PBoV 阳性，且组织样品中的检出率显著高于血清及精液样品中的检出率，这表明PBoV在我国猪群中相当流行，而且该病毒在不同组织器官中分布不同。2010年，翟少伦等核对北京市、河北省、安徽省和新疆维吾尔自治区PBoV阳性率大于70%以上样品信息，发现这些猪场的发病率和死亡率较高，并且病猪具有明显的呼吸症状，剖检时发现肺组织有病变[17-19]。

邓波等对上海市各区（县）规模猪场2006—2011年不同月份采集的1800份猪血清、45份猪粪便、27份猪鼻棉拭以及门诊采集的9份高热病死猪内脏进行检测，阳性率依次为24%、30%、0%、67%。对6份PBoV 阳性病料进行猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒 2 型（PCV2）的检测，结果阳性率依次为 0%、83%、0%和100%。检测结果表明，PBoV 感染在上海市普遍存在，从猪内脏器官组织中检出率较高，且春季和秋季发病率较高，仔猪相对比较易感，并与PRRSV、PCV2 存在混合感染的情况[20]。

2011年9月，中国动物卫生与流行病学中心从河南某屠宰场采集了临床健康猪只的组织样品进行猪群疫病流行病学调查，从部分样品中检测到了PBoV。同年，Li B等通过实时荧光PCR方法对258份猪样品进行检测，检测结果显示PBoV阳性率为44.2%，其中PMWS发病猪群的PBoV阳性率为56.1%，显著高于健康猪群的16.7%的阳性率[21]。Li B等还从具有腹泻症状病猪的粪便样品中鉴定出一株PBoVJS677株，经全基因组测序、比对发现，JS677株的全基因组与其他PBoV毒株的同源性为48.7%～86.3%，NS1和NP1基因的同源性分别为48.7%～86.2%和31.9%～82.1%，依据ICTV的分类标准，属于新型的PBoV，被命名为PBoV5[15]。

2011年，中国香港学者Lau SK等从香港生猪屠宰场和养猪场的健康猪和病死猪中采集333份健康猪和病死猪的淋巴结、血清和粪便等样品，通过PCR方法检出55份PBoV阳性样品，阳性率为16.5%。同时对PBoV全基因组进行测序和序列分析，发现了不同型PBoV毒株间存在重组事件[14]。胡军勇等对河南、湖北、湖南的各大猪场进行了流行病学调查，在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性，平均阳性率达到了69.35%，其中PBoV在4个规模化猪场的腹泻猪群中的阳性率达到 73.95 %，并显著高于非腹泻猪群（47.83 %）。本研究调查结果显示PBoV 在国内猪群中广泛流行，且感染率较高[22]。

2014年，Liu Mengmeng等人对在2006-2012年收集的来自中国5个省的403份腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、肺、肾、肝、脾等组织样品进行PCR检测，其中108份来自屠宰场，70份来自具有临床腹泻、咳嗽或者低烧症状的发病猪，150份来自60日龄的后备猪。检测结果显示PBoV阳性率为11.41%。其中腹股沟淋巴结和脾脏的检出率为27.18%和20.75%，显著高于下颌淋巴结（6.25%）和和扁桃体（1.30%），肺脏、肾脏、肝脏全为阴性。表明PBoV在山东的流行率（41.68%）高于河南（11%）和辽宁（10%）[23]。

4 检测方法

4.1 聚合酶链反应（PCR）

2010年，翟少伦等人参照当时GenBank发表的PBoV的唯一序列，在PBoV的 VP1和VP2基因区域设计了一对特异性的引物，初步建立了PBoV的PCR检测方法。该方法特异性强，敏感度高，重复性好，在国内首次建立了 PCR扩增检测PBoV的方法[19]。胡军勇等根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物，该方法能够从 PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段，特异性试验显示该方法对PRV、PPV和PCV2等核酸样品检测均为阴性，敏感性试验显示，该PCR方法对 PBoV 的最低检测量为213.6拷贝[21]。

为建立快速检测PBoV所有基因型的诊断方法，蔡雨函等根据GenBank中公布的PBoV的不同基因型序列，对其进行同源性分析，分别设计出扩增PBoV1/PBoV2 /PBoV3/ PBoV4/PBoV5的引物，在分别建立单一PCR检测方法的基础上，通过对两组引物的比例、退火温度等条件的优化，首次建立了同时检测（PBoV1～PBoV5）双重PCR方法。检测结果显示建立的双重PCR能成功检测出PBoV所有基因型，并能区分（PBoV1～PBoV5），通过特异性试验、敏感性试验及重复性试验验证了该方法的可靠性，为PBoV诊断和预防提供了技术支持[25]。

4.2 实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）

Li等建立了PBoV1的RT-PCR诊断方法，在对258份临床样品进行检测时，阳性率达44.2%，敏感性试验达到了20个质粒拷贝，特异性与重复性均较好[20]。上海市动物疫病预防控制中心邓波等根据GenBank公布的PBoV（PBoV）序列，通过VP1和VP2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PCV、PRRS、PPV及均无交叉反应，具有较高特异性，在107copies/mL～101copies/mL模板范围内具有良好的线性关系，所制作的标准曲线相关系数为0.997，最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好、精确性高和耗时短等优点[26]。

4.3 环介导等温扩增（LAMP）技术

李彬等建立了一种PBoV的LAMP检测方法，并根据方法和原理组装了一套检测试剂盒，该试剂盒含有4条引物，首先提取待检样品的核酸，然后利用LAMP检测试剂盒对提取的核酸进行检测，从而判断样品中是否含有PBoV。该试剂盒不需要先进的仪器设备，并且具有特异性强、敏感度高、耗时短、操作简便以及易于推广等优点[27]。

4.4 间接免疫荧光法

McKillen J等建立了PBoV的原代细胞培养系统，同时为了鉴定病毒在细胞上的生长情况，还建立了间接免疫荧光方法，结果在猪原代肾细胞的细胞核发现绿色荧光，而细胞核周围细胞质的颜色较暗[8]。

另外，李彬等将PBoV的 NP1、VP2基因进行了原核表达。结果表明，经IPTG诱导后，重组蛋白有很高的表达量，且以可溶性蛋白形式存在；经过柱纯化后，该蛋白纯度较高；Western Blot鉴定后证明该蛋白具有很好的反应原性。目前研究结果都表明NP1和VP2蛋白可作为诊断抗原的候选蛋白，为PBoV的血清学诊断方法奠定了基础[28-29]。

5 展望

目前，博卡病毒或博卡样病毒已经在奶牛、犬、人类、大猩猩和猪等多种动物宿主中被检测出来。据报道，博卡病毒在世界不同人类民族中的流行率为1.5%～24.6%，而且越来越多的证据显示博卡病毒是人类下呼吸道感染的病原体[30]。博卡病毒在国内外猪群中同样存在普遍感染，并且缺乏有效的防控措施。该病毒的临床致病机制目前尚不清楚，是否存在与其它病原体协同致病仍需进一步研究。鉴于整个生物循环系统中人类和猪的亲密关系，我们不能完全排除PBoV与人博卡病毒发生基因重组甚至感染人的可能性，因此，对PBoV深入研究还具有潜在的公共卫生学意义。

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A Summary of Researches on Porcine Bocavirus

Cai Kuojun，Chen Faxi，Li Aiqiao，Yang Qiyuan，Han Yong，Li Jianling，Fan Yujuan
（Urumqi Animal Disease Control and Diagnosis Centre，Urumqi，Xinjiang 830063）

Bocavirus is a newly discovered DNA virus infecting human，swine，bovine，canine，gorilla and other mammal species in recent years. In this paper，studies on porcine Bocavirus were summarized with regard to its biological characteristics，epidemiology and distribution both at home and abroad，so as to provide reference for further study on porcine Bocavirus and its effective prevention and control.

porcine Bocavirus（PBoV）；research；public health；epidemiology

S858.28

：A

：1005-944X（2015）02-0042-05

新疆维吾尔自治区科技厅科技援疆项目（201491165）；重庆市集成示范计划项目（cstc2014jcsf00001）

李爱巧