5种中药颗粒剂与水煎剂对5种耐药菌株的体外抑菌作用比较

李蔼文，谭俊青，王康椿，黄双旺，周 兵，刘启波

(广东省第二中医院检验科，广东广州510095)

目前，抗菌药物耐药菌的大量产生增加了临床患者死亡的危险性[1-2]，寻求能够对抗多重耐药菌的替代抗菌药物[3]已经成为全球关注的一个热点。中药抗菌有着悠久的历史，许多研究表明中药饮片对多重耐药细菌有明显的抑菌作用[4]。单味中药抑菌作用的研究多以水煎剂居多[5-6]，其作为中医临床用药的传统剂型，却有携带、煎煮不便的缺点。中药配方颗粒是以中药饮片为原料，经现代化制药技术提取、分离、浓缩、干燥、制粒、包装而成的颗粒状剂型，供中医临床配方时应用。它既保留了中药饮片的药性、药效，又不需要煎煮，质量可控[7]，是一种安全、高效、方便的现代中药制剂。目前，国内已可生产多种配方颗粒剂，但它能否保持传统水煎剂的药效，尚无明确定论。我们选取了有抑菌作用的5种中药(苦参、连翘、薄荷、薄公英、黄芩)，采用体外抑菌试验比较5种中药颗粒剂与水煎剂对临床分离的5种多重耐药菌的抑菌效果，为临床使用颗粒剂型中药提供实验依据。

材料和方法

一、实验选用材料

1.中药水煎剂 苦参、连翘、薄荷、蒲公英、黄芩由广东省第二中医院中药房提供并鉴定。

2.中药颗粒剂 苦参、连翘、薄荷、蒲公英、黄芩中药颗粒剂由广东一方药业公司提供，符合《中国药典》的规定。

3.临床耐药菌株 耐药菌株为从广东省第二中医院呼吸科、重症监护病房(intensive care unit，ICU)患者尿液、血液、痰标本中分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、产金属酶的铜绿假单胞菌、产β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌，产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBL)的大肠埃希菌、天然耐药的鲍曼不动杆菌。

4.药敏纸片 阿米卡星、氨苄西林、氨曲南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢唑啉、庆大霉素、亚胺培南、复方磺胺甲噁唑、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、氯霉素、头孢唑啉、环丙沙星、庆大霉素、苯唑西林、青霉素、万古霉素药敏纸片均购自Oxoid公司。万古霉素纸片含量为30 μg，亚胺培南纸片含量为10 μg。

5.仪器及培养基 梅里埃VITEK-2全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)。血平板购自江门市凯林贸易有限公司(批号140506)。MH平板购自江门凯林贸易有限公司(批号140512)。

二、方法

1.中药水煎剂的制备 称取中药饮片50 g，置于砂锅中，加10倍量水浸泡过夜，加热至沸后改用文火煎30 min，趁热过滤，滤渣另加8倍量水，同法煎煮30 min，过滤，合并2次滤液于同一烧杯中，水浴浓缩后放凉至室温，并于50 mL容量瓶中定容，再倒入输液瓶，盖薄膜，压胶塞和铝盖，高压(表压:0.7 kg/cm2，温度:115℃，时间:30 min)灭菌，取出放凉，即得1 mL相当于原药材1 g(1∶1)的中药煎剂溶液。

2.中药颗粒剂溶液的制备 用分析天平准确称取5种中药颗粒剂适量(相当于原中药饮片50 g)，分别置于烧杯中，用蒸馏水溶解，并在50 mL量筒中定容，再倒入无菌带盖容器中，高压(表压:0.7 kg/cm2，温度:115 ℃，时间:30 min)灭菌，取出放凉即得1 mL相当于原药材1 g(1∶1)的中药颗粒剂溶液。

3.耐药菌液的制备 将鉴定后的MRSA、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌在血平板上分纯，于37℃的培养箱中培养24 h。培养后取出细菌以生理盐水校正浓度至0.5麦氏浊度(相当于108CFU/mL)。

4.无菌小纸片的制备 将打孔器制成的小纸片(直径为5 mm)放入平皿中，高压(表压:0.7 kg/cm2，温度:115℃，时间:30 min)灭菌，取出放凉，即得实验用的无菌小纸片。

5.体外抑菌试验 采用药敏纸片琼脂扩散法进行体外抑菌试验。用无菌接种环将0.5麦氏浊度的菌液均匀涂布于M-H平板，中间选取一个抗菌药物纸片做阳性对照(MRSA选取万古霉素，其它4种细菌选取亚胺培南)，用无菌镊子在平板四周贴6片无菌的小纸片(5 mm)，左右两边各3片，静置10 min，左边3片用校准过的加样枪加入1 g/mL中药水煎剂溶液10μL，右边3片同样加入等量的同种中药颗粒剂溶液。于37℃的培养箱中培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈的直径，分别求出其均值()与标准差(s)。

三、试验结果判断标准

中草药对病原菌的抑菌效果目前国内外尚无统一标准，我们参照国内同类型的实验[8-9]的标准作为结果的判断依据:抑菌圈直径＞20 mm为高度敏感，10～19 mm为中度敏感，＜10 mm为不敏感。

四、统计学方法

结 果

一、5种临床分离耐药菌的耐药谱

见表 1、2。

二、5种中药对5种耐药菌的抑菌效果比较

除黄芩、连翘、薄荷对MRSA表现为敏感、黄芩对鲍曼不动杆菌表现为敏感外，其余中药对5种耐药菌均表现为不敏感或无抑菌作用。总的来说，黄芩的抑菌效果最好。见表3。

三、同一种中药水煎剂与颗粒剂的抑菌效果比较

表1 4种革兰阴性杆菌的耐药谱

对于MRSA，黄芩、连翘、薄荷、蒲公英、苦参2种剂型均有抑菌效果，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表2 MRSA的耐药谱

表3 5种中药水煎剂与颗粒剂对5种耐药菌的抑菌作用 (±s，mm)

表3 5种中药水煎剂与颗粒剂对5种耐药菌的抑菌作用 (±s，mm)

注:－表示无抑菌作用，+表示有抑菌作用

铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 鲍曼不动杆菌连翘 颗粒剂中药 剂型 MRSA 11.10 ±0.50 7.42 ±0.57 － － 6.20 ±0.3水煎剂 12.00±0.30 8.67±0.57 － － 7.10±0.5蒲公英 颗粒剂 7.10±0.20 － － － －水煎剂 7.66±0.30 － － － －黄芩 颗粒剂 19.00 ±0.90 6.65±0.10 7.6 ±0.3 6.2±0.57 11.00 ±0.5水煎剂 20.36 ±0.50 7.00 ±0.20 8.1 ±0.2 7.1 ±0.10 12.10 ±0.5薄荷 颗粒剂 13.70±0.14 6.50±0.59 － － 7.60±0.2水煎剂 15.35±0.57 7.83±0.59 － － 8.10±0.3苦参 颗粒剂 6.80±0.10 － － － －水煎剂 7.30±0.30 － － － －阳性对照+++++

对于耐药性铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌，黄芩、连翘、薄荷2种剂型均有抑菌效果，差异无统计学意义(P＞0.05);蒲公英，苦参2种剂型均无抑菌效果。

对于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，黄芩的2种剂型有抑菌效果，差异无统计学意义(P＞0.05);连翘、薄荷、蒲公英、苦参2种剂型均无抑菌作用。

讨 论

本研究选用的耐药菌株均从临床分离所得，对多种抗菌药物耐药。研究结果显示，5种中药无论颗粒剂或水煎剂对5种耐药菌株的抑菌作用各不相同。其中，黄芩抑菌效果最好，其2种剂型均对MRSA、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌有一定的抑菌效果。连翘、薄荷对MRSA、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌亦有一定的抑菌效果。虽然抑菌圈大小有一定的差异，敏感性亦不同，但提示这几种常用的中药有很好的应用前景，可用于细菌耐药性的研究，通过进一步分析体内抑菌活性，更好地指导临床用药。

同一种中药水煎剂与颗粒剂相比，同浓度的黄芩、连翘、薄荷、蒲公英、苦参，颗粒剂和水煎剂抑菌效果差异不明显。这与王育红等[10]的报道不一致。很多研究结果显示在体外抑菌试验(试管倍比稀释法)中，中药水煎剂明显要比颗粒剂抑菌效果好。分析与报道不一致的原因，可能有以下几方面的影响因素。

首先，与制备工艺和过程有关。中药汤剂一直沿用“一只砂锅二碗水，头煎二煎服下肚”的传统煎煮方法，既无加工工艺，又无质量标准，而且中药煎煮涉及到药材的浸泡、先煎后下、水量、火候、煎煮时间、煎煮容器等问题，操作相对复杂，在实际应用过程中，使饮片活性成分提取受到一定限制。导致煎剂出现质量不稳定、溶解不充分等缺点。李学林等[11]证明不同的煎煮方法对中药煎液的质量影响很大。

单味中药浓缩颗粒是按照国家中医药管理局《单味中药浓缩颗粒研制指南》要求，采用符合炮制规范的中药饮片为原料，经现代化科学提取、低温浓缩、喷雾干燥、干压制剂制成的现代“饮片”颗粒。其性味、归经、功能主治、用法用量与原中药饮片完全一致。但仍存在一些问题，如尚缺少统一的质量控制标准、包装规格少、对单味中药浓缩颗粒的应用剂量和原饮片剂量没有科学的折算等。同时，在配制过程中，颗粒剂称取的量和溶解性等问题有可能会导致颗粒剂的实际浓度比理论浓度高。因此，这就需要科研人员不断挖掘与探索中药药效，分析其物理与化学特性，并与更多的水煎剂比较，为其临床使用颗粒剂型中药提供实验依据。

其次，与实验方法也有关。本研究采用药敏纸片法，是一种半定量的试验方法，操作简便，工作量小，但纸片所吸附的药量不易确定，且吸附到纸片上的药液扩散不同，故可能会影响药物的抑菌效果[12]。试管连续稀释法[13]操作的工作量大，但它能够精确测出各种中草药的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。而且药物在液体环境中，抑菌有效成分具有较好的扩散性，能持续地作用于细菌。因此，应进一步做试管稀释法，测定MIC，更准确地判断颗粒剂与水煎剂的抑菌效果。

中草药的清热解毒药理作用，主要体现为抗病原微生物、抗病毒、清热、抗炎、增强机体免疫力等，故深入研究中药对细菌的体内体外的抑菌作用，无论是颗粒剂或水煎剂，对控制耐药菌的感染与蔓延具有非常重要的实际意义。

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