一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测坦布苏病毒方法的建立

刘青涛， 李 银， 赵冬敏， 刘宇卓， 黄欣梅， 杨 婧， 韩凯凯， 安凤娇

(江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014)

坦布苏病毒(Tembusu Virus，TMUV)为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)，该病毒于1955年首次分离于马来西亚吉隆坡地区的库蚊，随后又在马来西亚其他地区和泰国的库蚊中分离到［1-3］。2000年，在马来西亚霹雳州实兆远地区的患病肉鸡中分离到TMUV，这是首次发现TMUV对家禽的致病性［4］。2010年春季，在中国东部省份主要养鸭地区的鸭群中暴发了由TMUV引起的疫情，主要表现为种鸭、蛋鸭釆食量和产蛋率迅速下降，肉鸭拉稀，出现神经症状和死亡，此次疫情一直持续到2010年冬季［5-7］。2011年10月，在江苏、山东、河南等地再次出现鸭坦布苏病毒病的流行，一直持续到2012年3月。2012年9月，江苏、山东等地再次发生鸭坦布苏病毒病［8］。目前坦布苏病毒病作为鸭的一种常见病，给中国养鸭业造成了巨大经济损失。据不完全统计，鸭坦布苏病毒病仅2010年造成的经济损失就达数十亿元。此外，TMUV还可以引起鸡和鹅的感染和发病［9-10］，并且在人的血清中也检测到TMUV的核酸和抗体［11］，不排除TMUV有人畜共患的风险。

实时定量PCR是近年来发展起来的一种新型诊断技术，在各种疾病特别是传染性疾病的快速诊断中发挥了重要作用。常规PCR通过PCR产物的琼脂糖凝胶电泳判定结果，而实时定量PCR是通过添加的荧光染料或荧光标记探针在PCR过程中实时收集检测信号，根据机器收集的荧光信号强度进行结果的判定，减少了试验污染和环境污染。因此，与常规PCR相比，实时定量PCR的敏感性更高，检测速度更快，并且更环保。国内学者根据TMUV基因的不同区域建立了多种用于TMUV检测的实时定量RT-PCR，于春梅等建立了基于TMUV NS5、E基因的SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法［12］，万春和等根据TMUV的NS5基因设计引物建立了SYBR GreenⅠ实时定量 RT-PCR 方法［13］，彭珊和靳宇田等分别根据TMUV的E基因和PrM基因设计引物和探针建立了TaqMan实时定量RT-PCR方法［14-15］，以上方法均具有很好的特异性和敏感性，为鸭坦布苏病毒病的临床病原学诊断提供了检测手段。但是，以上实时定量RT-PCR均采用两步法，即在提取样品的RNA后首先进行反转录，然后再以转录产物为模板进行实时定量PCR方法测定，操作比较繁琐，增加了试验过程中的操作误差和样品被污染的几率。而本研究针对TMUV基因的保守区域设计了1对特异性引物，利用体外转录的TMUV病毒的NS2A基因作为标准品制作标准曲线，建立了TMUV的一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测方法。与两步法相比，本方法操作简单，检测快速，减少了试验过程中的操作误差和样品被污染的几率，为TMUV的快速诊断和流行病学研究提供有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

坦布苏病毒(TMUV)、新城疫病毒(NDV)、H9N2禽流感病毒(H9N2 AIV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)、小鹅瘟病毒(GPV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、猪瘟病毒(CSFV)均由江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存。1日龄樱桃谷鸭购自南京市六合区，养至21日龄用于攻毒。

1.2 仪器和试剂

RNA/DNA和质粒提取试剂盒购自康宁公司，T7体外转录试剂盒购自百奥迈科生物技术有限公司，反转录试剂盒、One Step RT-PCR Kit购自宝生物工程(大连)有限公司，ABI 7500 Real-Time PCR System购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 引物设计与合成

根据本实验室分离的病毒株以及GenBank登录的TMUV全基因核苷酸序列，采用DNAStar软件进行同源性分析，选出高度保守并且特异的核苷酸区域，用Primer Ex-press 2.0软件设计1对检测引物，其序列为 D1:5'-GCAGCCCAGGAGATTTTGAG-3'和 D2:5'-CTAACGCAACGCCAAGCA-3'，扩增片段大小为280 bp。另外，设计1对克隆引物将NS2A基因连接到pcDNA3.1(+)载体中，其序列为C1:5'-GGTCGGATCCTTTCAAGGGG-3'和C2:5'-CTGGTCTAGATCTCCGTGTCACTGG-3'。

1.4 病毒核酸的提取

按照试剂盒说明进行病毒核酸的提取，以提取的核酸为模板直接进行一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测。

1.5 标准品的制备

将提取的TMUV核酸按照试剂盒说明进行反转录，以转录产物为模板用引物C1和C2 PCR扩增TMUV的 NS2A基因，然后将扩增基因片断用BamH I和 Xba I进行双酶切，连接到 pcDNA3.1(+)载体中，经测序正确后用于体外转录，并命名为pcDNA-NS2A。

将质粒pcDNA-NS2A经Xba I单酶切进行线性化，然后按照试剂盒的说明进行体外转录，将体外转录产物用RNA提取试剂盒纯化后，进行浓度测定、拷贝数计算、稀释、分装，-70℃保存备用。

1.6 敏感性试验和标准曲线的建立

将体外转录制备的标准品进行10倍系列稀释(1 μl 1×100～1×107拷贝)作为模板进行实时定量RT-PCR扩增，以检测出的最低拷贝数作为该方法的灵敏度，并与常规RT-PCR检测方法进行比较，同时根据测定结果绘制标准曲线。实时定量RT-PCR的扩增体系为:2 ×Buffer 10 μl，酶 0.8 μl，引物 D1(10 μmol/L)0.8 μl，引物 D2(10 μmol/L)0.8 μl，ROX Reference DyeII 0.4 μl，RNA 1 μl，H2O 6.2 μl。扩增程序为:42℃ 5 min，95 ℃ 10 s;95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，40个循环，以3～15个循环数的荧光值作为基底值。

1.7 特异性试验

用建立的一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法分别对 NDV、H9N2 AIV、DHV、DPV、GPV、EDSV、CSFV进行检测，以TMUV为阳性对照，以灭菌超纯水为阴性对照，评价所建立方法的特异性。

1.8 重复性试验

用建立的一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法对不同拷贝数的标准品进行3次定量测定，对结果进行统计分析，计算批内及批间的变异系数，验证所建立方法的重复性。

1.9 对TMUV攻毒样品的检测

取TMUV 0.2 ml［病毒含量为0.1 ml 1×105.7(鸡胚半致死量)］肌肉注射3只21日龄樱桃谷鸭，每只106［鸡胚半致死量(ELD50)］，攻毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、21 d 每天采集攻毒鸭的泄殖腔拭子，反复冻融3次后提取RNA，分别用一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法和常规PCR方法进行检测，同时设不攻毒的鸭为对照，比较2种方法的检出率。

2 结果

2.1 敏感性试验及标准曲线的建立

标准品(1 μl 1×100～1×107拷贝)的检测结果显示，建立的一步法SYBR Green实时定量RTPCR的检测底限为1 μl 10拷贝(图1)，而常规RT-PCR 的检测底限为 1 μl 1×103拷贝(图 2)。根据标准品拷贝数与Ct值进行标准曲线(图3)绘制，标准曲线的决定系数为0.997，扩增效率(Eff)为99.441%，说明所建立的标准曲线具有良好的线性关系和扩增效率。此外，由熔解曲线(图4)可见，各扩增样品均为单一峰，无非特异性产物。以上结果说明，所建立的方法可以对大于等于1 μl 10拷贝的样品进行精确定量。

图1 扩增曲线Fig.1 Amplification plot

图2 常规PCR敏感性试验Fig.2 Sensitivity of the conventional RT-PCR

DL2000:Marker;100、101、102、103、104、105、106、107为模板稀释浓度。

2.2 特异性试验结果

一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法对NDV、H9N2 AIV、DHV、DPV、GPV、EDSV、CSFV 和灭菌超纯水的检测结果均为阴性，而对TMUV的检测结果为阳性(图5)，这说明所建立的方法具有良好的特异性。

图3 标准曲线Fig.3 Standard curve

图4 溶解曲线Fig.4 Melt curve

图5 特异性试验Fig.5 Specificity test

2.3 重复性试验结果

由表1可知，各样品的批内变异系数为0.11%～0.30%，批间变异系数为 0.88%～1.31%，说明所建立的方法重复性良好。

表1 重复性试验结果Table 1 Reproducibility test

2.4 对TMUV攻毒样品的检测

由TMUV攻毒鸭泄殖腔棉拭子的检测结果(表2)显示，常规RT-PCR在攻毒后1 d，只从1只鸭的拭子中检测到TMUV，21 d时已检测不出TMUV;而一步法SYBR Green实时定量RT-PCR在攻毒后1 d到21 d在所有攻毒鸭的泄殖腔拭子中均检测到了TMUV，其阳性检出率为100%，而常规RT-PCR的阳性检出率为71%。以上结果进一步说明本研究建立的TMUV检测方法的敏感性远远高于常规RTPCR检测方法。此外，2种方法对对照鸭的检测结果均为阴性。

3 讨论

由于集约化养殖模式的发展，鸭的养殖密度越来越大，发病情况也越来越复杂，往往是几种病原(包括新出现的病原)共同感染或者继发感染发病，给疾病的诊断和处置造成了困难。2010年以来，鸭坦布苏病毒病在中国已经发生了3次较大规模的流行，目前该病在中国已成为鸭的一种常见病［5-8］。鸭坦布苏病毒病作为一种新发疫病，因临床症状不特异而难以诊断，因此迫切需要建立一种快速、准确的病原检测方法来对该病进行实验室诊断。

本研究以TMUV基因的保守区为靶点设计1对特异引物，建立了一步法SYBR Green实时定量RTPCR检测方法，并且对该方法的扩增曲线、标准曲线、溶解曲线、敏感性、特异性和重复性进行了分析和验证。结果表明，所建立的实时定量RT-PCR方法标准曲线的线性关系良好;对TMUV的最低检测量达到1 μl 10拷贝，灵敏度是常规RT-PCR检测方法的100倍;溶解曲线呈单一峰，并且只能检测出TMUV，与其他病原无交叉反应，具有良好的特异性;批内和批间变异系数较小，具有良好的重复性。利用建立的荧光定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法对不攻毒对照鸭和TMUV感染鸭的泄殖腔棉拭子进行了检测，结果表明2种方法对于对照鸭的检测结果均为阴性;而对于攻毒鸭一步法SYBR Green实时定量RT-PCR法检测出TMUV的阳性率为100%，比常规RT-PCR方法高出29个百分点。因此，与常规RT-PCR方法相比，我们建立的一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法检测速度更快、更敏感，更适合于临床样品的检测。

表2 TMUV攻毒鸭泄殖腔棉拭子测定结果Table 2 Detection of TMUV in cloacal swabs from TMUV infected ducks

本研究建立的一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法为坦布苏病毒病的实验室诊断提供了一种快速有效的方法，也为开展坦布苏病毒病的流行病学调查提供了技术手段。

［1］ PLATT G S，WAY H J，BOWEN E T，et al.Arbovirus infections in Sarawak，October 1968-February 1970 Tembusu and Sindbis virus isolations from mosquitoes ［J］.Ann Trop Med Parasitol，1975，69(1):65-71.

［2］ 张敬峰，李 银，赵冬敏，等.鸭源坦布苏病毒株NJX-4的分离鉴定及部分生物学特性［J］.江苏农业科学，2013，41(11):228-229，297.

［3］ 韩凯凯，李 银，黄欣梅，等.鹅新型坦布苏病毒囊膜蛋白的二级结构与B细胞表位预测［J］.江苏农业科学，2014，42(6):166-169.

［4］ KONO Y，TSUKAMOTO K，ABD HAMID M，et al.Encephalitis and retarded growth of chicks caused by Sitiawan virus，a new isolate belonging to the genus Flavivirus［J］.Am J Trop Med Hyg，2000，63:94-101.

［5］ 曹贞贞，张 存，黄 瑜，等.鸭出血性卵巢炎的初步研究［J］.中国兽医杂志，2010(12):3-6.

［6］ LIU P P，LU H，LI S，et al.Genomic and antigenic characterization of the newly emerging Chinese duck egg-drop syndrome flavivirus:genomic comparison with Tembusu and Sitiawan viruses［J］.J Gen Virol，2012，93:2158-2170.

［7］ 胡旭东，路 浩，刘培培，等.我国发现的一种引起鸭产蛋下降综合征的新型黄病毒［J］.中国兽医杂志，2011，47(7):43-47.

［8］ 刘志刚，孙青松，姚 蓉，等.鸭坦布苏病毒研究进展［J］.中国动物传染病学报，2013，21(1):81-86.

［9］ 黄欣梅，李 银，赵冬敏，等.新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定［J］.江苏农业学报，2010，27(2):354-360.

［10］ LIU M，CHEN S，CHEN Y，et al.Adapted tembusu-like virus in chickens and geese in China ［J］.J Clin Microbiol，2012，50(8):2807-2809.

［11］ TANG Y，GAO X，DAO Y，et al.Tembusu virus in Human，China［J］.Transboundaiy and Emerging Diseases，2013，60:193-196.

［12］于春梅，刁有祥，唐 熠，等.坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立［J］.中国农业科学，2012，45(21):4492-4500.

［13］万春和，朱海侠，施少华，等.鸭坦布苏病毒SYBR Green I实时荧光定量检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2013，33(7):973-978.

［14］彭 珊，闫丽萍，李国新，等.鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化［J］.中国预防兽医学报，2013，35(4):294-298.

［15］靳宇田，黄显明，许秀梅，等.鸭坦布苏病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立及应用［J］.中国动物传染病学报，2013，21(4):46-50.