Ni(Ⅳ)配合物－鲁米诺化学发光新体系测定饲料中的磺胺脒

孙佳丽，刘 怡，郑英帅，宋泽安，石红梅

(河北医科大学 公共卫生学院，河北 石家庄 050017)

磺胺脒(Sulfaguanidine，SG)为临床上常用的短效磺胺类药物，具广谱抗菌作用，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有良好的抗菌活性，是预防和治疗细菌感染性疾病的重要药物，常用于治疗细菌性痢疾和肠炎，或用于预防肠道手术后感染等，现经常作为饲料添加剂使用，是动物源性食品兽药残留检测中的常见药物。磺胺类药物残留能引起人体中毒或过敏性反应，并被怀疑有致癌性。作为一种重要的磺胺类药物，磺胺脒在磺胺类药物的使用中占有很大比例。因此，建立一种操作简便、快速、灵敏的磺胺脒检测新方法，用于饲料或食品兽药残留的检测，对于动物源性食品的安全监测具有实际意义。

目前磺胺脒的检测方法主要有分光光度法［1－2］、高效液相色谱法［3－4］、液相色谱－串联质谱法［5］、胶束液相色谱法［6］、伏安测定法［7］等，但这些方法操作相对复杂、分析成本较高，且达不到快速在线分析的目的。化学发光法(Chemiluminescence，CL)凭借其测定灵敏、仪器简单、操作方便、分析成本低等优点，目前在药物、生物、农业、医学等分析领域得到了广泛应用［8－14］。本课题组在前期工作中，首次发现并报道了Ag(Ⅲ)配合物与鲁米诺的化学发光体系，并已成功用于某些生物分子和药物的测定［15－18］。

文献检索发现，有关Ni(Ⅳ)配合物－鲁米诺化学发光法测定磺胺脒的研究尚未见报道。Ni(Ⅳ)配合物与Ag(Ⅲ)配合物均为超高氧化态金属配合物，与Ag(Ⅲ)配合物相比，Ni(Ⅳ)配合物(［Ni(HIO6)2］4－，化学结构式如图1)的氧化性能较温和，与鲁米诺的化学发光反应更稳定。本实验基于磺胺脒在碱性介质中对Ni(Ⅳ)配合物－鲁米诺(Luminol，Lu)化学发光体系的抑制作用，首次建立了流动注射－Ni(Ⅳ)配合物－鲁米诺化学发光体系测定磺胺脒的新方法。该方法灵敏度高，用于饲料中磺胺脒的测定，结果满意，方法具有一定的实际应用前景。

1 实验部分

图1 ［Ni(HIO6)2］4－配合物的化学结构式Fig.1 Chemical structure of［Ni(HIO6)2］4－ complex

1.1 仪器及试验方法

仪器采用IFFM－E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)，流路见图2，聚四氟乙烯管(PTFE，0.8 mm i.d.)用于连接系统中的所有组件。实验选择负高压为700 V，Ni(Ⅳ)溶液先与鲁米诺溶液经三通管混合均匀并充分反应，待基线稳定后，通过进样阀将磺胺脒溶液注入到Ni(Ⅳ)配合物与鲁米诺的混合液流中，记录Ni(Ⅳ)配合物－Lu化学发光体系被磺胺脒抑制的信号强度，即相对化学发光强度(Ni(Ⅳ)配合物－Lu基线的CL信号强度减去Ni(Ⅳ)配合物－Lu－SG体系的CL信号强度)，以峰高定量。每次实验前后均用去离子水将各塑料软管冲洗干净。

图2 流动注射化学发光流路示意图Fig.2 Schemmatic diagram of flow injection system forCL detection

1.2 溶液配制

磺胺脒(Sigma公司)标准储备液(2.3×10－3mol/L):称取磺胺脒标准品0.010 0 g，溶于80～90℃热水中，以水定容至20 mL。

鲁米诺(Sigma公司)储备液(2.0×10－2mol/L):称取鲁米诺标准品0.886 0 g，溶于7 mL 1.0 mol/L NaOH溶液中，用水定容至250 mL。

Ni(Ⅳ)配合物按文献方法［19］制备:将3 g高碘酸钾溶于50 mL沸水中，在搅拌条件下向此溶液中加入2 g Ni(NO3)2·6H2O加热至微沸，分次加入总计5 g的过硫酸钾，继续煮沸30 min，冷却后加入50 mL 3.6 mol/L的KOH溶液，搅拌，于40～50℃反应1 h，生成暗红色的Ni(Ⅳ)配合物 ［Ni(HIO6)24－］。扫描发现该溶液有两个吸收峰，依据配合物溶液在410 nm处的摩尔吸光系数(ε=1.06×105L·mol－1·cm－1)，计算Ni(Ⅳ)配合物储备液的浓度约为2.4×10－3mol/L。配合物储备液在冰箱中保存备用。

实验用水均为去离子蒸馏水。

1.3 样品处理

取市售猪饲料样品1.0 g置于10 mL塑料离心管中，加入5 mL高氯酸溶液(pH 2.0)涡流振荡5 min，振荡提取5 min，并超声萃取10 min，再以6 500 r/min离心10 min后，取上清液。重复提取3次，合并提取液，用C18固相萃取柱分离富集待测饲料样品中的磺胺脒。步骤如下:取1 mL水和1 mL甲醇依次滴加到固相萃取柱上，反复3次，将饲料提取液滴加到固相萃取柱上，用5 mL冷水淋洗，3 mL甲醇洗脱。收集样品洗脱液，40℃下用氮气吹至近干，用80～90℃水稀释至8 mL，过0.22 μm滤膜后，平均分为4份，1份做空白，其余3份样品溶液中分别加入磺胺脒标准储备液30，60，100 μL，4份溶液均稀释定容至100 mL。

2 结果与讨论

鲁米诺、Ni(Ⅳ)配合物、样品及载流的流速对化学发光强度有一定影响。实验发现液体流速为2.5 mL/min时，反应信号最强且稳定，故将流速定为2.5 mL/min。

2.1 反应介质及其浓度的影响

2.1.1 Ni(Ⅳ)配合物溶液浓度及碱度的选择 在鲁米诺浓度为1.0×10－6mol/L(溶液碱度为0.005 mol/L)，磺胺脒浓度为2.4×10－6mol/L，Ni(Ⅳ)配合物溶液碱度为0.01 mol/L条件下，考察了Ni(Ⅳ)配合物溶液浓度在5.0×10－9～5.0×10－6mol/L范围内变化对该体系相对化学发光强度的影响，结果表明:Ni(Ⅳ)配合物溶液浓度为4.0×10－7mol/L时，体系的发光强度抑制信号最大且较稳定。故选择Ni(Ⅳ)配合物的最佳浓度为4.0×10－7mol/L。

在0.01～0.07 mol/L范围内改变NaOH浓度，考察了Ni(Ⅳ)配合物溶液的碱度对该体系相对化学发光强度的影响(图3)。结果显示:随着Ni(Ⅳ)配合物的碱度增加，磺胺脒对Ni(Ⅳ)配合物－Lu体系化学发光信号的抑制强度先升高后降低，在NaOH浓度为0.02 mol/L，即Ni(Ⅳ)配合物溶液碱度为0.02 mol/L时，发光体系抑制信号最强，故将Ni(Ⅳ)配合物中NaOH浓度定为0.02 mol/L。

图3 Ni(Ⅳ)配合物溶液碱度对体系发光信号的影响Fig.3 Effect of［OH－］in Ni(Ⅳ)complex solution on CL intensity cNi(Ⅳ)complex=4.0 × 10－7mol/L;cSG=2.4×10－6mol/L;cLu=1.0×10－6mol/L(in 0.005 mol/L OH－)

2.1.2 鲁米诺浓度及碱度的选择 在0.005 mol/L OH－介质中，考察了鲁米诺浓度在1.0×10－8～1.0×10－5mol/L 范围内对该体系发光强度的影响。结果表明，鲁米诺浓度为7.0×10－8mol/L时，发光体系的信噪比最好，且抑制信号最强。故将鲁米诺的浓度定为7.0×10－8mol/L。

考察了鲁米诺溶液中NaOH的浓度在0.01～0.08 mol/L范围内对该化学发光体系的影响(图4)。结果表明，当NaOH浓度为0.05 mol/L时，化学发光的抑制强度最佳。

图4 鲁米诺溶液碱度对发光信号的影响Fig.4 Effect of［OH－］in luminol solution on CL intensity cNi(Ⅳ)complex=4.0 × 10－7mol/L(in 0.02 mol/L OH－);cSG=2.4×10－6mol/L;cLu=7.0 × 10－8mol/L

2.2 工作曲线、检出限与精密度

在上述优化条件下，对磺胺脒系列标准溶液进行检测，结果表明，磺胺脒在6.0×10－7～6.0×10－6mol/L浓度范围内与相对化学发光强度(ΔI)呈良好的线性关系，其回归方程为ΔI=115.3×107c+3 859.2，相关系数(r)为0.994。以信噪比大于3的最小峰所对应的标准品浓度为检出限，得到该方法的检出限为2.4×10－10mol/L。在优化条件下，对2.4×10－6mol/L的磺胺脒标准溶液进行11次平行测定，根据峰高计算得到其相对标准偏差(RSD)为1.4%。

2.3 样品分析

在优化条件下，将4份饲料样品溶液按“1.3”方法处理，取1份做空白溶液测定，其余3份进行加标实验。空白样品稀释液无明显抑制信号，表明未检出磺胺脒。在另3份空白样品处理液中分别加入磺胺脒标准储备液30，60，100 μL，稀释定容至 100 mL，制得低、中、高3个浓度水平的加标溶液，每个浓度平行测定3次，取平均值，计算得平均回收率为102.2%～104.3%，结果见表1。实验结果显示，加标回收合理但回收率在100%以上，可能是由样品处理液中含有对该化学发光体系同样有抑制信号的其它极微量杂质引起的。

表1 样品溶液中磺胺脒的加标回收率实验结果Table 1 Recovery results of sulfaguanidine from real samples

2.4 讨论

2.4.1 化学发光反应机理推断 在Ni(Ⅳ)配合物与鲁米诺组成的化学发光检测体系中，Ni(Ⅳ)配合物既可氧化鲁米诺产生发光(基线信号)，又可氧化磺胺脒，从对Ag(Ⅲ)配合物与鲁米诺化学发光体系的前期研究［16］结果推断，可能的化学发光反应机理为:Ni(Ⅳ)配合物和鲁米诺及磺胺脒的反应均为自由基反应，且磺胺脒与Ni(Ⅳ)配合物反应较鲁米诺与Ni(Ⅳ)配合物的反应慢，反应过程中鲁米诺产生的自由基部分转移给磺胺脒，从而使鲁米诺自由基减少，发光体的量减少，使得体系的发光强度降低，因此表现为信号抑制。

2.4.2 Ni(Ⅳ)配合物－鲁米诺发光体系 以鲁米诺为还原剂的经典化学发光体系广泛用于金属离子、无机及有机物的痕量分析中。已建立的鲁米诺发光体系有H2O2，K3Fe(CN)6，HIO4－Luminol等。本研究首次采用Ni(Ⅳ)配合物作氧化剂，与鲁米诺组成新的化学发光体系。Ni(Ⅳ)配合物的氧化能力与其浓度、碱度在一定范围内成正相关。浓度过大，配合物可能聚集;碱度改变，配合物在溶液中的平衡可能改变，可使配合物的氧化能力发生变化，从而影响体系的相对化学发光强度。Ni(Ⅳ)配合物溶液浓度变化对体系发光强度的影响呈增强－降低－再增强－降低趋势，其影响的复杂性，可能与Ni(Ⅳ)配合物在不同条件下配位平衡发生改变，从而其氧化能力发生变化有关。

3 结论

本文建立了测定磺胺脒的高灵敏Ni(Ⅳ)配合物流动注射化学发光分析新方法，并对饲料样品中的磺胺脒进行了测定，对化学发光可能的机理进行了简要说明。该方法简单、灵敏、快速，具有一定的应用前景。

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