双歧杆菌Ⅱ型毒素—抗毒素系统—MazEF的分子进化分析

韦艳霞+刘佃滨+郑纪伟+等

【摘要】 目的：对双歧杆菌属编码的Ⅱ类毒素-抗毒素（TA）系统MazEF进行分子进化分析。方法：利用PSI-BLAST在NCBI中搜索获得双歧杆菌编码的MazF分子序列，在NCBI蛋白数据库、核酸数据库分别下载其他菌属基因组编码的MazF蛋白序列和本研究所涉及菌属的16 S rRNA序列，应用Clustal X2和MEGA4软件对MazF做分子进化分析。结果：共搜索到双歧杆菌株染色体编码毒素蛋白MazF 26个。分子进化分析显示：整个双歧杆菌属的MazF保守性不好；MazF与16 S rRNA的共进化仅在个别菌种中发现，大部分MazF的聚类结果与相应菌种16 S rRNA的聚类结果不同。结论：双歧杆菌中的TA系统MazEF可能是通过基因的水平转移整合入基因组中，属于菌株非核心基因组部分。

【关键词】 MazEF； 毒素-抗毒素系统； 分子进化； 双歧杆菌

Ⅱ类毒素-抗毒素（TA）系统，最早在1982年于大肠埃希菌的低拷贝质粒中发现。其后发现，TA系统同样存在于细菌染色体上，也存在于一些外源DNA岛如噬菌体、转座子、超级内含子和质粒中，由于近年来发现其参与细菌的多种应激调控过程而被广泛关注[1]。生物信息学分析发现：多达750个细菌和古细菌的基因组中存在Ⅱ类TA系统；自生微生物的基因组中一般含有多个Ⅱ类TA系统编码基因，而在严格的胞内微生物基因组中未发现Ⅱ类TA系统编码基因；以上证据提示Ⅱ类TA系统对微生物的生存具有重要作用。主流观点认为：TA系统可能作为一个特殊的压力反应原件，在细菌对不利环境的应激调控过程中发挥重要作用[2-3]。根据TA系统中氨基酸序列的相似度，Ⅱ类TA中的毒素蛋白被分为9个家族，包括CcdB、RelE、MazF、ParE、Doc、VapC、ζ、HipA以及HigB[3]。根据毒素蛋白的分类，相应TA系统被分为9类。其中，MazEF是最早在大肠埃希菌基因组中发现、研究最为深入的Ⅱ类TA系统之一，参与细菌对营养饥饿、抗生素、高温、DNA损伤等应激反应调控[1，4]。

双歧杆菌（Bifidobacterium）是母乳喂养的婴儿肠道中的优势菌，具有对宿主多方面的益生作用，如拮抗肠道病原体、调节免疫、平衡肠道菌群等[5-20]。作为一种模式益生菌，双歧杆菌经常与其他乳酸菌一起用于益生菌制品的生产，在食品、医药、畜牧等领域应用广泛。作为益生菌使用的双歧杆菌在工业加工、储藏、运输以及进入宿主胃肠道的过程中会遭遇各种环境胁迫，如酸、热、氧气、营养匮乏和高渗透压等各种不利刺激。目前，已经有近40株双歧杆菌进行了全基因组测序，但是它们的基因组中是否存在MazEF、它们分子的进化关系如何、是否参与双歧杆菌对多种不利环境的应激调控均不清楚。由于构成TA系统的一对毒素蛋白（MazF）和抗毒素蛋白（MazE）处于共进化的状态，MazF的进化状态可以代表TA系统MazEF的进化状态[21]。因此，本研究通过对双歧杆菌MazF的进化分析间接研究MazEF的分子进化。作者在NCBI数据库中获得双歧杆菌编码的MazF，对其进行多序列比对；进一步将来自双歧杆菌属和其他菌属的毒素蛋白MazF和菌株16 S rRNA的进化分析结果进行比较，完成对双歧杆菌MazEF的分子进化分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 MazF蛋白和16 S rRNA序列菌株来源均下载自NCBI，包括B. longum，B. breve，B. stellenboschense，B.ruminantium， B. kashiwanohense， B. bifidum， Streptococcus mutans， Mycobacterium tuberculosis， Escherichia coli， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus johnsonii。

1.2 方法 MazF蛋白和16 S rRNA序列获取通过PSI-BLAST在NCBI中搜索，获得双歧杆菌染色体编码的MazF；通过NCBI蛋白数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）下载其他菌属染色体编码的6个MazF序列；而16 S rRNA序列下载自NCBI核酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）。

1.3 统计学处理 分别应用Clustal X2和MEGA4软件进行多序列比对和进化图绘制。

2 结果

2.1 双歧杆菌染色体编码MazF情况 共搜索到双歧杆菌染色体编码毒素蛋白MazF 26个。其中，21个MazF编码基因存在于B. longum、B. breve染色体上，其余位于其他5种双歧杆菌染色体中，见表1。双歧杆菌中MazF蛋白序列由99～129个氨基酸构成，见图1。

2.2 MazF分子进化分析 通过Clustal X2对26个双歧杆菌染色体上的MazF蛋白分子进行多序列比对，结果如图1。选取来自6种双歧杆菌的代表性MazF蛋白序列和其他菌株MazF进化分析，并将结果与16 S rRNA分子进化分析结果相比较见图2。

3 讨论

TA系统通常由处在同一个操纵子中紧密连锁的两个基因组成；其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白或RNA，另一个基因编码相对稳定的毒素蛋白。根据抗毒素的成分不同，通常将TA系统分为三类：Ⅰ类的抗毒素为反义mRNA，Ⅱ类的抗毒素基因编码抗毒素蛋白。前者可以抑制毒素蛋白mRNA的翻译，从而阻止毒素蛋白发挥作用；后者可以与毒素蛋白结合形成蛋白复合体，达到抑制毒素的作用。而III类TA系统中的抗毒素虽然也是RNA，但是其抑制毒素作用的机制与Ⅱ类不同，它是通过抗毒素与毒素蛋白形成RNA-蛋白质结构发挥毒素抑制作用[22]。

MazEF是最早于大肠埃希菌基因组中发现的Ⅱ类TA系统，由处于同一操纵子、紧密连锁的两个基因mazE和mazF编码。上述两个基因均编码小分子蛋白，其中mazE编码不稳定的抗毒素蛋白，mazF编码相对稳定的毒素蛋白[23]。一般情况下，MazE和MazF形成蛋白复合体，处于动态平衡状态，细菌正常生长。由于MazE没有MazF稳定，需要不断的合成MazE维持平衡状态，因此在某些情况下，如氨基酸饥饿、抗生素等不利刺激下，MazE被降解或合成受到抑制，其含量相对于MazF减少，从而引起细菌的死亡或生长抑制[24]。研究发现：MazEF参与氨基酸饥饿、高温和DNA损伤等恶劣环境下菌株的应激调控，在细菌压力调控过程中发挥重要作用[1，24]。

双歧杆菌MazF多序列比对分析虽然发现了双歧杆菌MazF的保守区域（黑色、灰色区域），然而整个双歧杆菌属基因组上的MazF保守性不好，仅个别菌种内的MazF具有较好的保守性，如B. breve基因组上的MazF保守性较好。进一步分子进化分析显示：MazF的聚类结果与相应菌种16 S RNA的聚类结果不一致，MazF与16 S RNA的共进化仅在个别菌种中发现，如B. breve和B. longum中的MazF。上述结果提示：双歧杆菌中的MazEF可能是通过基因的水平转移整合入基因组中，属于菌株的非核心基因组部分，具有较大的流动性。上述编码MazEF的双歧杆菌株可能具有某些不利环境下的生存优势。

参考文献

[1] Hazan R S B， Engelberg-Kulka H. Escherichia coli mazEF-mediated cell death is triggered by various stressful conditions[J].J Bacteriol，2004，186（11）：3663-3669.

[2] Makarova K S，Wolf Y I，Koonin E V.Comprehensive comparative-genomic analysis of type 2 toxin-antitoxin systems and related mobile stress response systems in prokaryotes[J].Biol Direct，2009，4（5）：19.

[3] Pandey D P，Gerdes K.Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes[J].Nucleic Acids Res，2005，33（3）：966-976.

[4] Van Melderen L，Saavedra De Bast M.Bacterial toxin-antitoxin systems： more than selfish entities[J].PLoS Genet，2009，5（3）：e1000437.

[5]林麦连.三联疗法联合双歧杆菌对幽门螺杆菌感染的消化性溃疡的治疗作用分析[J].中国医学创新，2011，18（8）：163-164.

[6]李春亮，周丽，李海艳.100例新生儿轮状病毒感染临床诊治及感染防控[J].中国医学创新，2013，10（4）：127-128.

[7]农智新.益生菌提高幽门螺杆菌根除率的临床研究[J].中国医学创新，2012，9（28）：100-101.

[8] Vlasova A N，Chattha K S，Kandasamy S，et al.Lactobacilli and bifidobacteria promote immune homeostasis by modulating innate immune responses to human rotavirus in neonatal gnotobiotic pigs[J].PLoS One，8（10）：e76962.

[9]俞龙.口服双歧杆菌活菌制剂治疗肠易激综合征的疗效观察[J].中国医学创新，2011，8（6）：34-35.

[10] Mogna L，Del Piano M，Mogna G.Capability of the Two Microorganisms Bifidobacterium breve B632 and Bifidobacterium breve BR03 to Colonize the Intestinal Microbiota of Children[J].J Clin Gastroenterol，2014，48（1）：S37-39.

[11]夏扬潮，刘宁，罗宜辉.益生菌联合谷参肠安治疗腹泻型肠易激综合征的疗效观察[J].中国医学创新，2012，9（13）：109.

[12]白俊华.双歧杆菌口服联合腹部抚触治疗早产儿喂养不耐受[J].中国医学创新，2013，10（1）：114-115.

[13]周伟.双歧杆菌与婴幼儿健康[J].实用儿科临床杂志，2002，17（3）：72-73.

[14]朱明哲，刘红.双歧杆菌治疗早产儿喂养不耐受疗效观察[J].滨州医学院学报，2007，1（2）：149-150.

[15]李荷清，赵晓燕.双歧杆菌四联活菌片联合四磨汤口服液治疗早产儿喂养不耐受[J].国际护理学杂志，2010，4（7）：1040-1041.

[16]廖镇宇，黄瑞文，肖艾青.双歧杆菌三联活菌胶囊防治低出生体重早产儿喂养不耐受疗效观察[J].儿科药学杂志，2013，13（3）：72-73.

[17]杨莲，张国梅.双歧杆菌三联活菌胶囊治疗早产儿喂养不耐受疗效观察[J].中外健康文摘，2011，8（45）：110-111.

[18]周建，方锦平，蒋璐瑶.双歧杆菌三联活菌散治疗晚期早产儿喂养不耐受的效果[J].中国乡村医药，2014，5（11）：56-57.

[19]陈红芳，周建.双歧杆菌三联活菌散在晚期早产儿喂养不耐受中应用[J].健康必读（中旬刊），2013，12（6）：89-90.

[20]王华，乔林霞，朱文英，等.早期口服双歧杆菌三联活菌散对早产儿喂养不耐受的影响[J].中国血液流变学杂志，2013，5（2）：21-23.

[21] Zhang Y X，Li J，Guo X K，et al.Characterization of a novel toxin-antitoxin module， VapBC， encoded by Leptospira interrogans chromosome[J].Cell Res，2004，14（3）：208-216.

[22] Fineran P C，Blower T R，Foulds I J，et al.The phage abortive infection system， ToxIN， functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（3）：894-899.

[23] Engelberg-Kulka H，Hazan R，Amitai S.mazEF： a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria[J].J Cell Sci，2005，118（19）：4327-4332.

[24] Lemos J A，Brown T A J r，Abranches J，et al.Characteristics of Streptococcus mutans strains lacking the MazEF and RelBE toxin-antitoxin modules[J].FEMS Microbiol Lett，2005，253（2）：251-257.

（收稿日期：2014-07-28） （本文编辑：王宇）

[17]杨莲，张国梅.双歧杆菌三联活菌胶囊治疗早产儿喂养不耐受疗效观察[J].中外健康文摘，2011，8（45）：110-111.

[18]周建，方锦平，蒋璐瑶.双歧杆菌三联活菌散治疗晚期早产儿喂养不耐受的效果[J].中国乡村医药，2014，5（11）：56-57.

[19]陈红芳，周建.双歧杆菌三联活菌散在晚期早产儿喂养不耐受中应用[J].健康必读（中旬刊），2013，12（6）：89-90.

[20]王华，乔林霞，朱文英，等.早期口服双歧杆菌三联活菌散对早产儿喂养不耐受的影响[J].中国血液流变学杂志，2013，5（2）：21-23.

[21] Zhang Y X，Li J，Guo X K，et al.Characterization of a novel toxin-antitoxin module， VapBC， encoded by Leptospira interrogans chromosome[J].Cell Res，2004，14（3）：208-216.

[22] Fineran P C，Blower T R，Foulds I J，et al.The phage abortive infection system， ToxIN， functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（3）：894-899.

[23] Engelberg-Kulka H，Hazan R，Amitai S.mazEF： a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria[J].J Cell Sci，2005，118（19）：4327-4332.

[24] Lemos J A，Brown T A J r，Abranches J，et al.Characteristics of Streptococcus mutans strains lacking the MazEF and RelBE toxin-antitoxin modules[J].FEMS Microbiol Lett，2005，253（2）：251-257.

（收稿日期：2014-07-28） （本文编辑：王宇）

[17]杨莲，张国梅.双歧杆菌三联活菌胶囊治疗早产儿喂养不耐受疗效观察[J].中外健康文摘，2011，8（45）：110-111.

[18]周建，方锦平，蒋璐瑶.双歧杆菌三联活菌散治疗晚期早产儿喂养不耐受的效果[J].中国乡村医药，2014，5（11）：56-57.

[19]陈红芳，周建.双歧杆菌三联活菌散在晚期早产儿喂养不耐受中应用[J].健康必读（中旬刊），2013，12（6）：89-90.

[20]王华，乔林霞，朱文英，等.早期口服双歧杆菌三联活菌散对早产儿喂养不耐受的影响[J].中国血液流变学杂志，2013，5（2）：21-23.

[21] Zhang Y X，Li J，Guo X K，et al.Characterization of a novel toxin-antitoxin module， VapBC， encoded by Leptospira interrogans chromosome[J].Cell Res，2004，14（3）：208-216.

[22] Fineran P C，Blower T R，Foulds I J，et al.The phage abortive infection system， ToxIN， functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（3）：894-899.

[23] Engelberg-Kulka H，Hazan R，Amitai S.mazEF： a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria[J].J Cell Sci，2005，118（19）：4327-4332.

[24] Lemos J A，Brown T A J r，Abranches J，et al.Characteristics of Streptococcus mutans strains lacking the MazEF and RelBE toxin-antitoxin modules[J].FEMS Microbiol Lett，2005，253（2）：251-257.

（收稿日期：2014-07-28） （本文编辑：王宇）