复方微量元素注射液对高原型藏羊淋巴细胞增殖的影响

2014-12-31曾朝蓉蒋忠荣胡延春

四川畜牧兽医 2014年8期

余劲，曾朝蓉，蓝岚，蒋忠荣，胡延春

（1.四川省甘孜州动物疫病预防控制中心，四川康定 626000；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014；3.四川省雅安市雨城区人民医院，四川雅安 625014；4.四川省甘孜州畜牧业科学研究所，四川康定 626000）

微量元素是指生物体内含量不足万分之一的元素，它们在动物体内虽然含量极小，但在机体正常生命活动中起着重要作用。到目前为止，已被确认与人和哺乳动物的健康和生命有关的必需微量元素有16种：铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、镍、氟、钥、钒、锡、硅、锶、硼。大量研究表明，微量元素对动物机体激素的合成、酶的活性、繁殖机能、机体免疫力等都有重要的影响。缺乏微量元素或者微量元素不平衡均会导致动物机体内分泌功能紊乱，激素和酶的生物活性降低，抵抗力下降。淋巴细胞是机体免疫应答过程中的核心细胞，淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程中的一个重要阶段，常作为测定细胞免疫功能的一个指标。为了探讨微量元素对高原型藏羊细胞免疫功能的影响，本试验测定了肌肉注射微量元素制剂后高原型藏羊的淋巴细胞增殖率，以期为临床应用及进一步阐明微量元素制剂增强免疫功能的机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物。体重13kg±1kg的高原型藏羊24只，甘孜州畜牧科学研究所提供。

1.1.2 试验药品。复方微量元素注射液，四川农业大学动物医学院内科实验室提供，主要成分为葡萄糖酸锌（C12H22O14Zn）、亚硒酸钠（Na2SeO·35H2O）、硫酸铜（CuSO4·5H2O）、氯化铬（CrC13·6H2O）、偏钒酸钠（Na－VO3·2H2O）、柠檬酸铁（C6H5FeO7·5H2O）、氯化钴（Co－Cl·26H2O）、硫酸锰（MnSO·4H2O）。

1.1.3 实验器材。高压灭菌锅、光学显微镜、数显恒温水浴锅、离心机、电子天平、血细胞计数板、微量加样枪等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组及用药。将24头藏羊随机分成4组，每组6头，每组初始体重无显著性差异（P>0.05）。其中，I组分点肌肉注射生理盐水（0.2mL/kg，作为对照组），II组（低剂量组）、III组（中剂量组）、IV组（高剂量组）分别按0.1、0.2、0.4mL/kg剂量分点肌肉注射复合微量元素注射液（作为试验组），隔1d注射1次，共注射2次。

1.2.2 血清采集及处理。在注射复合微量元素制剂后 0、15、30、45、60 d，颈静脉无菌采血 3 mL，肝素抗凝，用于测定淋巴细胞增殖率。

1.3 指标测定

1.3.1 淋巴细胞转化率测定（MTT法）

1.3.1.1 淋巴细胞悬液制备。取对照组（I组）藏羊的血样2mL与等体积D-Hanks液混匀，无菌吸取淋巴细胞分离液4mL置于15mL离心管中，将稀释血液在距分离液界面上1cm处沿离心管壁缓慢加至分离液面上，保持二者界面清晰，勿使血液混入分离液内，室温下以2000r/min离心20min，吸取白色淋巴细胞层，移入另一离心管，再加入5倍体积的经37℃预热的D-Hanks液，混匀，1000r/min离心 15～20min，弃去上清液，如此洗涤2次。用0.6%台盼蓝染色计数，保证活细胞数达95%以上。将淋巴细胞用不含血清的RPMI-1640血清培养液配制成浓度为5×106个/mL的细胞悬液。

1.3.1.2 淋巴细胞培养和测定。取无菌96孔微量培养板，每孔加入上述细胞悬液100μL和CoA 100μL（浓度为2.5μg/mL），每个样品3个重复，同时设置1个对照组（淋巴细胞悬液200 μL）和1个空白组（不含淋巴细胞的RPMI-1640血清培养液200 μL），置于37℃、5%CO2下培养48h，吸出上清液，加入MTT应用液10μL，继续培养6h，然后各孔加入100μL DMSO（二甲基亚砜）裂解，用酶联免疫检测仪检测每孔的OD570值，以刺激指数（SI）判断淋巴细胞的增殖功能。

SI=（试验组OD570值-空白组OD570值）/（对照孔组OD570值-空白组OD570值）

1.4 数据分析数据测定结果采用生物学统计法分析，以“平均数±标准差”表示，并用t检验检测其差异显著性。

2 结果

测定结果显示，随着时间的增加，对照组的淋巴细胞增殖率差异不显著（P>0.05）；而试验组的淋巴细胞增殖率显著升高（P<0.05），30 d达到最高值，差异极显著（P<0.01），随后缓慢降低。其中，III组（即中剂量）组的效果最佳。具体结果详见表1。

表1 淋巴细胞转化增殖试验SI值

3 分析

3.1 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体免疫机能的状态，是测定机体免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷者，其淋巴细胞转化率低于正常值，淋巴细胞转化率升高，则说明其免疫力增强。

赵金香（2005）研究表明，在日粮中添加酵母铁（150mg/kg）可显著提高仔猪T淋巴细胞转化率，增强仔猪的免疫力。李秀霞等（2005）发现，缺铜能降低小鼠组织器官中的铜浓度和细胞免疫功能，而在基础日粮的基础上添加4.5mL/kg蛋氨酸铜和硫酸铜均能显著提高T淋巴细胞转化率，促进脾脏发育。徐迪雄等（1995）研究发现，适量补充锌可促进胸腺、脾脏生长，增强T淋巴细胞活性，提高免疫力。张庆东等（2006）研究表明，饲粮中添加2.0mg/kg铬可显著提高鸡胸腺重量和T淋巴细胞转化率（P<0.01）。本试验在注射复方微量元素制剂后，T淋巴细胞转化率显著升高，这是由于复方微量元素制剂中多种微量元素协同作用的结果。

3.2 本试验在注射复方微量元素制剂后第30d，淋巴细胞增殖率达到最高值，第30d后缓慢降低，但仍显著高于对照组（P<0.05）。这可能是由于微量元素在体内代谢过程中被逐渐消耗掉，而饲粮中的微量元素仍然处于缺乏状态所造成的。