红假单胞菌的分离鉴定及有机肥盐度对其生长的影响

钟 倩

（四川省威远县严陵镇农业服务中心，四川 威远 642450）

红假单胞菌属于光合细菌的一种，而光合细菌是一类能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作供氢体兼碳源进行不放氧光合作用的微生物，在水产养殖、有机肥生产等方面具有广泛的应用。光合细菌的生长受很多因素的影响，而盐度会直接影响它的生长。本文通过连续平板涂布法从混合光合细菌中分离筛选出红假单胞菌，然后将其接种在有机肥中进行光照厌氧培养，研究有机肥盐度对红假单胞菌生长的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种来源 光合细菌菌株由重庆江合生物技术有限责任公司提供，红假单胞菌菌种是从含有红假单胞菌的二级光合细菌菌液中分离纯化而得。

1.2 有机肥样品 有机肥由重庆永丰农业综合开发有限责任公司提供，产品主要由鸡粪经过有氧发酵而成。

1.3 培养基

1.3.1 分离培养基。乙酸钠3.0g、丙酸钠0.3g、氯化钠0.1g、硫酸铵0.3g、七水硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾 0.5g、氯化钙 0.05g、硫酸锰 0.025g、酵母膏0.1g、蛋白胨0.1g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，混合，将pH调至7.2～7.4，经121℃高压灭菌30min，即成固体分离培养基。再用同样的培养基分离富集红假单胞菌和扩大培养分离出的菌种。

1.3.2 不同盐度有机肥培养基的配制。取无菌培养皿12个，6个梯度盐度，每个梯度配制2个培养基。取100g有机肥溶于100mL水中，通过加入NaCl母液调控每个盐度梯度，再加入琼脂2g，121℃下高压灭菌20min，即成有机肥培养基。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种培养方法。将配制好的培养基分装于150mL锥形瓶中，装液量为120mL，用8层纱布牛皮纸封口，液面铺一层无菌液体石蜡隔绝氧气，121℃下灭菌20 min。接种纯菌种5%，于光照恒温培养箱中培养 72～96h（温度 28～31℃，光照强度 1500～3000勒克斯）。

1.4.2 菌种分离。从重庆江合生物技术有限责任公司取来的菌种本身是经过富集的优势种为红螺菌科的菌液，因此通过分离培养基反复震荡培养和分离，重复几次，直至镜检出纯培养物，即可得到分离后的菌种悬浮液。将配制好的分离培养基分别制成无菌固体琼脂培养基和无菌液体培养基，液体培养基灭完菌加2%酒精。挑取红色单个菌落，划线接种于固体培养基上，表层再覆盖无菌琼脂，制成厌氧培养基，光照厌氧培养，培养条件为30℃、3000勒克斯（lx）光照强度。待出现红色菌落，连续如此分离3次即可分离出纯培养假单胞菌株。观察菌落形态特征，镜检确定为纯培养物，然后做细菌标本片，观察菌体形态特征。最后挑取纯培养物穿刺于半固体琼脂柱中，上面覆盖一层约2 cm高的无菌混合石蜡，待长出丰满的穿刺物后，备用或作菌种保存。配制液体培养物：挑取纯培养物于之前配制好的灭菌液体培养基中，液体培养基上面铺一层1～2 cm液体石蜡，30℃、3 000 lx光照条件下厌氧培养，后期试验备用。

1.4.3 菌种鉴定。革兰氏染色 ：将纯培养物接种于液体培养基中，光照厌氧条件下培养18h左右，对菌体进行革兰氏染色。菌落形态、培养特征和菌体形态学观察：待培养皿中长出菌落时，观察琼脂平板上生长的菌落形态及颜色，并制成细菌标本片，在显微镜下观察菌体形态。

1.4.4 有机肥不同盐度的设置。盐度设置为6个梯度，分别为 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，每个梯度设置2个重复，盐度采用NaCl母液调控，28℃下光照厌氧恒温箱中培养。

1.4.5 红假单胞菌的计数。采用平板菌落计数法将之前保存好的菌种悬液依次稀释至 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，在振荡机上振荡，使菌液充分混合。每个梯度的盐度设2个培养皿，分别加入10-7稀释度的菌种液，每个梯度2个重复。用2支1mL无菌吸管分别吸取10-7的稀释液各0.1mL，放入已做好的含不同盐度值有机肥培养基的培养皿中，用无菌玻璃棒将菌液涂布均匀，并覆盖一层液体石蜡，立即放入同一生化培养箱中，调至30℃、3000lx下进行光照厌氧培养。48h后，取出培养平板，对各培养皿中形成的菌落计数，算出不同稀释度、相同盐度的平板上形成的平均菌落个数，并按下列公式进行计算：1mL菌种悬浮液中菌落形成单位（cfu）＝菌落数×稀释倍数×10。

2 试验结果

2.1 分离菌落的形态特征 挑取3株菌株在平板上划线培养（黑暗好氧条件下），分别编号 A1、A2、A3，第5d观察到菌株均生长良好，然后经分离培养基连续3次平板划线培养后，分离出单个菌落，观察其形态特征。镜检结果详见表1。

表1 分离菌落的形态特征

2.2 纯培养菌株的形态特征及培养特征 取分离得到的纯培养物制作细菌抹片，分别编号B1、B2、B3，在显微镜下观察，其形态学特征及光照厌氧培养的特征如表2所示。

从表1、表2可知，黑暗好氧条件下，菌种不一定呈红色，而光照厌氧培养时，液体呈红色，说明其体内不一定含有红色光和色素，但在光照条件下，它能迅速合成红色光和色素。

表2 纯培养菌株的形态及光照厌氧培养特征

由表1、表2可以看出，3个菌株均为卵形或杆状，以单根极生鞭毛运动；主要以二分裂或不对称分裂为增殖方式；革兰氏染色呈阴性；厌氧光照和好氧黑暗条件下均能生长；液体培养的菌种呈红色。这些特征与《伯杰细菌鉴定手册》（第8版）所描述的红假单胞菌属相符，因此该分离出的纯培养物为红假单胞菌属。

2.3 平板菌落计数结果 详见表3。

表3 不同盐度培养基中细菌的生长情况

从表3可以看出，红假单胞菌在给定的盐度范围内均能生长，在盐度为0.4%时生长最好，随着w（NaCl）的继续升高，红假单胞菌的生长情况直线下降。

3 分析与讨论

3.1 盐度对红假单胞菌的影响 有机肥中盐度直接影响光合细菌的生长。由于培养基的盐度是由不同离子组成的，盐度的高低其实是离子浓度的高低，因此，对盐度适应能力的不同，显示了菌株对营养物质吸收能力的不同。分离出的红假单胞菌在盐度为0～0.8%范围内生长良好，且在0.4%时生长最好，说明该菌适应低盐水体。所以应根据不同的水质情况，选择合适的光合菌株。

3.2 盐度对培养基的影响 高盐度的培养基会降低营养物质的数量，营养物质在低盐度时比在高盐度和不加氯化钠时要多，低盐度对营养物质有保护作用，但随着浓度的增加，保护作用随之降低，当浓度达较高时，营养物质的耐热性显著减弱，直接影响培养基中营养物质的保存，最终影响到红假单胞菌株的生长繁殖。

4 结论

采用连续平板涂布法能从混合光合细菌中分离筛选出红假单胞菌；有机肥中的盐度直接影响红假单胞菌的生长，在盐度为0～0.8%范围内生长良好，且在0.4%时生长最好。

[1]吴向华，杨启银，刘五星，等.光合细菌的研究进展及其应用[J].中国农业科技导报，2004，6（2）:35-38.

[2]徐福乐，纵明，杨峰，等.生物有机肥的肥效及作用机理[J].耕作与栽培，2005，（6）:8-9.

[3]李勤生，谭德清，王业勤.微生物饲料添加剂对养殖鱼类的促长作用[J].水生生物学报，1990，14（4）:368-371.

[4]Larimer FW， Chain P， Hauser L， et al.Complete genome sequence of the metabolically versatile photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas Palustris[J].Nat.Biotechnol，2004，22（1）:55-61.

[5]刘芳，王敏，杨慧，等.净化养殖水体紫色非硫光合细菌的筛选与鉴定[J].中国生物工程杂志，2008，28（8）:91-95.

[6]王立超，连岩，张志新.温度、光照和pH之间的相互关系对光合细菌生长的影响[J].海洋湖沼通报，1997，（4）:29-31.

[7]冯波，赵红卫，张迅，等.高活性沼泽红假单胞菌分离及对垃圾渗滤液处理的研究[J].安徽农业科学，2010，38（24）:13322-13324.

[8]张新英，莫天砚，刘斌.红假单胞菌的分离及菌种保存试验研究[J].广西师范学院学报（自然科学版），2001，18（2）:9-12.

[9]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社，2001:13-14.

[10]肖克宇，陈昌福.水产微生物学[M].北京:中国农业出版社，2004:352-354.

[11]RE布坎南，NE吉本斯，等.中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译.伯杰细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社，1984:23-28.

[12]倪黎纲，王志鹏，罗方妮，等.氧、光照时间、pH等理化因子影响光合细菌生长的研究[J].内陆水产，2004，（3）:41-42.

[13]谢红刚，王三反，褚润.光合细菌培养条件的研究[J].环境科学与技术，2007，30（5）:19-20.

[14]刘朝阳，孙晓庆.影响固体培养基凝固的因素[J].南方水产，2007，3（1）:69-74.