拟南芥AtMYB50和AtMYB61蛋白的原核表达研究

杜李继， 顾 菊， 陈光朗， 孙成磊， 阳立波， 曹树青

（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

0 引 言

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白分子，在拟南芥中鉴定了1 600多个转录因子［1］，其中MYB基因占整个转录因子总数的9%［2］，其特征是N端具有高度保守的MYB结构域。MYB基因在植物的生长发育和环境胁迫响应中发挥重要作用［3］。MYB基因可分为 R1R2R－MYB、R2R3－MYB 和 R1－MYB 3类［4］。绝大多数MYB蛋白被鉴定为正调控因子，但也有少数为负调控因子［5］。目前，这类抑制因子被认为属于R2R3家族的亚类，研究证实，有些MYB基因的过量表达可显著增强植物对环境胁迫的耐受性［6］。

大多数拟南芥MYB基因的表达受到1种或多种激素或胁迫的诱导，这说明了该基因家族在逆境胁迫应答方面的重要性［7］。本文利用RTPCR方法克隆了AtMYB50和AtMYB61基因的cDNA，并构建了pET－32a＋和pGEX－4T－1原核表达载体和蛋白，为后续对这2个MYB转录因子之间的相互作用及其对下游靶基因调控的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

拟南芥（Arabidopsisathaliana）哥伦比亚野生型（Col－0），购于美国拟南芥种质资源中心，由本实验室繁衍保存。

1.1.2 主要试剂

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购于Fermentas公司；RNAiso Plus总RNA抽提试剂盒、限制性内切酶BamH I、Sal I和 Xho I、PrimeSTAR MAX DNA Polymerase购于TaKaRa公司；T4DNA连接酶、pEASY－Blunt Simple Cloning Kit、Easy Taq、BL21（DE3）plysS Chemically Competent Cell购于北京Transgen公司；TIANGel MiDi Purification Kit、TIANquick MiDi Purification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit购于天根公司。

1.1.3 宿主菌和载体

平末端载体为pEASY－Blunt Simple Cloning Kit，感受态细胞为 Trans1－T1Chemically Competent Cell，原核表达大肠杆菌菌株为BL21（DE3）plysS Chemically Competent Cell，原核表达载体为pET－32a＋和pGEX－4T－1。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥植株培养

本实验将Col－0种子用75%乙醇浸洗1min，然后用移液枪除去乙醇溶液，再用5%次氯酸钠浸洗2min，用无菌水洗5次以除去残留次氯酸钠液，将种子晾干后点于MS固体培养基上，于4℃春化3d，最后置于光强度为100μmol／（m2·s）、光周期为16／8h、培养温度为23℃的条件下培养3周。

1.2.2 拟南芥AtMYB50、AtMYB61基因克隆

RNAiso Plus总RNA抽提试剂盒抽提组织中总RNA，详细方法见说明书。

以总RNA为模板，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA。根据TAIR中提供的基因cDNA序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，并在正向和反向引物的5′端加上所需的酶切位点。其中AtMYB50R－pGE引物的酶切位点前多加1个碱基C，防止在蛋白表达时移码。实验所需引物及酶切位点如下：

以cDNA为模板用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase高保真扩增酶进行PCR扩增，反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收纯化目的条带。

将回收纯化的基因片段与pEASY－Blunt Simple Cloning Kit平末端载体连接，转入Trans1－T1感受态细胞中，用含有100μg／mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑取单菌落进行菌落PCR验证，并接种于100μg／mL Amp－LB液体培养基，37℃、O／N 培养。用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒，用双酶切切下目的条带，电泳检测，回收纯化。测序并确认序列无误。

1.2.3 原核表达载体的构建

pET－32a＋和pGEX－4T－1用相应的限制性内切酶进行完全双酶切，电泳检测并回收载体片段，与回收好的目的基因片段相连，转化至Trans1－T1感受态细胞，用含有100μg／mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑取单菌落，置于100μg／mL Amp－LB液体培养基，37℃、O／N培养。用 TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒，PCR验证，双酶切验证，即为构建好的原核表达载体。

1.2.4 重组原核表达载体转化至表达菌株

将重组质粒转化至表达菌株BL21（DE3）plysS Chemically Competent Cell，用含有100μg／mL氨苄青霉素（Amp）和20μg／mL氯霉素（Chl）的 LB固体双抗培养基筛选阳性克隆。挑取单菌落，置于100μg／mL Amp－LB、20μg／mL Chl双抗液体培养基，37℃、O／N培养，菌液PCR验证。

1.2.5 目的蛋白表达及SDS－PAGE电泳

将转化至表达载体的BL21菌株接种于100μg／mL Amp－LB培养基，37 ℃、O／N 培养，然后加入IPTG，30℃继续培养2～3h，诱导表达目的蛋白。取100μL菌液5 000r／min离心，去上清液，用上样缓冲液重悬菌体，沸水浴10min。制胶上样，50V浓缩30min，然后100V分离1h。考马斯亮蓝染色10min后脱色液脱色，置于脱色摇床上过夜脱色，根据脱色情况更换脱色液。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增拟南芥基因

提取拟南芥植株总RNA，用RT Kit反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增AtMYB50、AtMYB61基因片段。电泳结果与目的片段大小一致。AtMYB50目的基因如图1a所示，长度为942bp。AtMYB61基因如图1b所示，长度为1 098bp。

图1 电泳检测PCR扩增目的片段

2.2 拟南芥基因连接转化与质粒酶切

将目的基因与pEASY－Blunt载体连接并导入大肠杆菌 Trans1－T1感受态细胞中，用含100μg／mL Amp的LB平板筛选阳性单克隆。挑取单菌落于LB中扩培，以菌液为模板进行菌落PCR，重组质粒菌落PCR结果电泳检测分析及酶切验证如图2所示。

由图2可看出，扩增出的条带均为阳性结果。用 BamH I 和 Sal I 对 pEASY－Blunt－At-MYB50pET32和 pEASY－Blunt－AtMYB50pGEX质粒完全双酶切，将AtMYB50基因从重组载体上切下，电泳检测回收纯化。同样用BamH I和Xho I对 pEASY－Blunt－AtMYB61pET32重组载体完全酶切，电泳检测并回收纯化。酶切所得片段带有酶切位点的黏性末端，可与双酶切后的表达载体相连。

图2 重组质粒菌落PCR结果电泳检测及酶切验证

2.3 原核表达载体的构建

2.3.1 完全双酶切原核表达载体

用BamH I、Sal I双酶切 pET－32a＋载体，BamH I、Xho I完全双酶切pET－32a＋载体，酶切后的pET－32a＋载体约为5.9kbp，如图3a、图3b所示。BamH I、Sal I双酶切pGEX－4T－1载体，酶切后约4.9kbp，如图3c所示，电泳检测结果验证了酶切结果。

图3 载体酶切回收后电泳检测结果

2.3.2 原核表达重组载体的构建

将双酶切回收所得的含有黏性末端的目的基因片段和酶切回收后含有黏性末端的原核表达载体相连［8］，用T4DNA连接酶于25℃10min，立即转化Trans1－T1感受态细胞，经活化后涂布于含有Amp（100μg／mL）抗性的LB平板上，阳性菌落在10～12h后长出。挑取单菌落，置于100μg／mL Amp－LB液体培养基，37℃、O／N 培养。用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒，PCR验证，双酶切验证。将构建好的原核表达载体质粒转化入表达菌株BL21，用于原核表达目的蛋白。

2.4 目的蛋白的表达及水溶性鉴定

转化入表达载体的BL21菌株37℃、O／N培养，然后加入IPTG，30℃继续培养2～3h，诱导表达目的蛋白，SDS－PAGE电泳检测有目的条带，说明目的蛋白表达成功。

在菌体破碎后对蛋白进行分离和纯化，对蛋白水溶性进行鉴定，结果如图4所示。

图4 融合蛋白的水溶性鉴定

由图4可知，融合表达蛋白主要存在于细胞碎片沉淀中，细胞破碎上清中也含有部分蛋白，后续实验将进一步进行蛋白纯化。

为使重组表达载体在表达菌株中最优表达［9］，获得大量目的蛋白，对原核表达的条件（IPTG浓度、诱导温度及诱导时间等）进行了优化，在温度为30℃下用浓度为1.0mmol／L的IPTG诱导2h，表达的蛋白量最大。

目的蛋白表达条件优化如图5所示。

图5 目的蛋白表达条件优化

3 讨 论

MYB基因不仅调控植物的正常生长发育，而且参与了逆境胁迫的应答调节。因此，研究该家族基因的分子调控网络具有十分重要的意义。MYB50和MYB61属于R2R3的亚类，在植物抗环境胁迫的调节中起着非常关键的作用。此外AtMYB50和AtMYB61在MYB家族中有非常近的亲缘关系，其DNA结合结构域具有非常高的序列一致性，因此两者可能对下游靶基因起到协同调控的作用。本文利用原核表达系统表达纯化了MYB50和MYB61蛋白，为进一步研究2个基因的生化功能，特别是AtMYB50和AtMYB61蛋白之间相互作用及对下游靶基因的调控机理奠定了基础。

随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理研究不断深入，利用转基因技术将外源抗逆基因导入植物基因组，在提高植物抗逆性、改良农作物遗传性状及培育农作物优良品系等方面具有广阔的应用前景［10－11］。

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