狐臭柴叶片中果胶提取条件的初步研究

李祥栋，张明生，刘诗雅

（贵州大学生命科学学院 贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳 550025）

狐臭柴叶片中果胶提取条件的初步研究

李祥栋，张明生，刘诗雅

（贵州大学生命科学学院 贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳 550025）

以狐臭柴叶为原料、柠檬酸为酸解液提取果胶，采用单因素实验、正交实验对酸浓度、提取温度、料液比和提取时间等条件进行探索，并以响应面实验设计方法进行工艺优化。结果表明：酸浓度和料液比是影响果胶酸解的主要因子；一定范围内，酸浓度与果胶粗产率（Y1）呈线性正相关，料液比与果胶粗产率（Y1）呈线性负相关，二者与粗果胶半乳糖醛酸含量（Y2）的关系符合二元二次多项式方程模型，但随着酸浓度的增加和料液比的降低，半乳糖醛酸含量有下降趋势；半乳糖醛酸提取率（果胶有效提取率Y3）的拟合效果是一个平均值模型，即Y3=8.86%。在提取温度、提取时间分别为90 ℃和120 min，响应面的优化条件为酸浓度3.91%、料液比1∶44.09时，果胶粗产率、半乳糖醛酸含量和果胶有效提取率分别为36.72%、32.09%和11.78%。

狐臭柴；果胶；半乳糖醛酸；提取条件

狐臭柴Premna puberulaPamp.又名神仙豆腐柴、斑鸠占等，隶属于马鞭草科Verbenaceae豆腐柴属PremnaLinn.的直立或攀援灌木至小乔木，分布于我国西南、西北、华南、华中等地区。狐臭柴是一种药食兼用植物，根、茎、叶中均含有多种药用成分[1-3]；叶片中果胶、蛋白质、纤维素、维生素等含量丰富[4-5]，民间采集其嫩叶和嫩枝制作成凝胶小吃，称为“神仙豆腐”、“观音豆腐”或“斑鸠饭”。狐臭柴叶片中果胶含量很高[6]，果胶是由α-半乳糖单体聚合而成的天然高分子化合物，通常被部分甲酯化，也有一些中性糖存在于果胶分子中[7-8]。在食品行业中，果胶被广泛用作果酱、果冻等食品的增稠剂和稳定剂。

有关狐臭柴的研究在国外几乎未见报道[9]，国内有部分学者在其果胶提取方面进行了初步探索[10-12]，但此方面的研究仍然较少，大都采用单一的无机酸进行热萃取，效果欠佳，且所用无机酸均为非食用酸，存在食品安全隐患。有人曾用柠檬酸对苹果渣和西番莲果皮中的果胶进行酸解提取[13-17]，效果较好。柠檬酸不仅因其3个解离常数不同的羧基而表现出较强酸性和缓冲能力，而且常用作饮品、点心等食品的调味剂。本实验采用柠檬酸提取狐臭柴叶片中的果胶，并对其提取条件进行筛选和优化，以期为狐臭柴中果胶的科学开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

狐臭柴Premna puberulaPamp.采自贵州省务川仡佬族苗族自治县，经贵州大学熊源新教授鉴定。

1.2 实验设计

1.2.1 单因素实验

分别设置不同梯度的柠檬酸浓度（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%）、提取温度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）、料液比即干叶粉与柠檬酸溶液之比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）和提取时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min），按照“实验方法1.3.2”的步骤（1）和（2）获得酸解液，定容至500 mL，以间羟基联苯法[16]测定酸解液中半乳糖醛酸含量并计算果胶提取率。

果胶提取率= 半乳糖醛酸含量/样品质量 ×100%。

1.2.2 正交实验

在分析以上单因素实验结果的基础上，采用L9(34)正交实验设计（表1），综合评价不同因素水平组合对果胶提取率的影响及其主次关系，并筛选适宜的酸解条件。

1.2.3 响应面设计

从节约原料的角度出发，基于上述单因素和正交实验结果，采用响应面法（RSM）设计原理进行工艺参数优化。选取柠檬酸浓度X1和料液比X2为自变量，果胶粗产率Y1（%）、粗果胶的半乳糖醛酸含量Y2（%）和果胶有效产率（半乳糖醛酸提取率）Y3（%）为响应值，按中心复合实验设计（CCD）安排实验因素和编码水平（表2）。其提取流程见“实验方法1.3.2”。

1.3 实验方法

1.3.1 材料预处理

于狐臭柴生长旺季（6～9月），采集新鲜叶片，洗净、晾干表面水分，置于105 ℃烘箱中杀青15～20 min后，迅速降温至60 ℃烘干至恒重。将干叶片研磨成粉末并过60目筛，置于干燥器中保存备用。

1.3.2 果胶酸解与提取

参照并改进Pinheiro等[17]提取果胶的方法。

（1）酸解：称取4.0～5.0 g（m）已制备好的狐臭柴干叶粉加入到具塞的500 mL大三角瓶中，分别加入相应浓度和体积的柠檬酸溶液，按实验设定的水浴温度进行酸解。

（2）抽滤：将酸解液趁热用1 mm孔径的双层纱布过滤并以布氏漏斗抽滤。

（3）沉淀：抽滤液以冷冻的等体积无水乙醇沉淀，4 ℃冰箱中静置1 h使果胶悬浮。

（4）过滤、烘干及测定：过滤收集悬浮的果胶并以无水乙醇清洗干净，45 ℃烘箱中烘干得到果胶粗品，磨细、称重（m1），计算果胶粗产率（Y1）；以间羟基联苯法测定粗品中半乳糖醛酸含量（Y2），并计算有效提取率（Y3，即半乳糖醛酸提取率）。

（5） 计 算 方 法：Y1=m1/m× 100%；Y3=Y1×Y2× 100%。

2 结果与分析

2.1 不同酸解条件对狐臭柴叶片果胶提取率的影响

酸浓度、温度、料液比和提取时间等条件对狐臭柴叶片果胶提取率均有较大影响。

在柠檬酸浓度为0.5%～3.5%（pH 3.37～1.88）范围内，果胶提取率与酸浓度呈显著正相关（柠檬酸浓度为3.5%时提取率最高，达9.20%）；当柠檬酸浓度超过3.5%（pH 1.84）时，果胶提取率几乎不再增加（图1）。这与柠檬酸pH的变化紧密关系（图1），低浓度的柠檬酸可迅速解离释放H+，而高浓度时解离速率变慢，从而影响其化学活性。

在一定范围内，果胶提取率随温度升高（60～80 ℃）而大幅度增加，这与分子热运动加剧和柠檬酸的解离程度增大有关；当温度高于80 ℃后，果胶提取率趋于稳定（图2）。料液比对酸解效果的影响较为明显，料液比过大（即干叶粉相对过多）不能使果胶完全酸解出来，提取率较低；随着料液比降低（即柠檬酸体积增大），果胶提取率也随之增高（图3），可能是因为H+与果胶分子糖苷键的作用频率增大所致；但当料液比降低到一定限度后（小于1∶50），果胶提取率逐渐降低，这可能是酸度相对过高造成的抑制作用。提取时间对酸解效果影响不是很大，但时间过长会使果胶提取率降低（图4），这可能与半乳糖醛酸的部分降解有关。

图1 酸浓度对果胶提取率的影响Fig. 1 Effects of acid concentration on pectin extraction ratio

图2 酸解温度对果胶提取率的影响Fig. 2 Effect of temperature on pectin extraction ratio

图3 料液比对果胶提取率的影响Fig. 3 Effect of solute/solvent on pectin extraction ratio

综上，在柠檬酸浓度为2.5%～3.5%、提取温度为80～90 ℃、料液比为1∶40～1∶50、提取时间为90～120 min范围内，狐臭柴干叶粉酸解效果较好，其果胶提取率较高。

图4 酸解时间对果胶提取率的影响Fig. 4 Effect of time on pectin extraction ratio

2.2 狐臭柴叶片果胶酸解提取的适宜条件

通过不同因素水平组合实验，即L9(34)正交实验，结果见表1。可以看出，不同处理间存在显著或极显著差异，处理7对狐臭柴叶片果胶的提取率最高（11.42%），即柠檬酸浓度3.5%、提取温度85 ℃、料液比1∶50、提取时间90 min的因素水平组合是狐臭柴叶片果胶酸解提取的适宜条件。极差分析与方差分析结果显示，各因素对果胶提取率的影响顺序为酸浓度（A）＞料液比（C）＞温度（B）＞时间（D），除提取时间外，其他因素的影响均达到显著或极显著水平。在一定的温度和时间范围内，酸浓度和料液比是影响狐臭柴叶片果胶提取率的主要因素。

表 1 正交实验结果的极差及方差分析†Table 1 ANOVA and range analysis for orthogonal experimental results

2.3 狐臭柴叶片果胶提取的响应面分析

不同变量水平组合及不同处理条件下的实验响应值（Y1、Y2、Y3）见表2，果胶粗产率（Y1）和半乳糖醛酸含量（Y2）的回归方程分别为（1）、（2）。

由回归方程可知，酸浓度、料液比和果胶粗产率表现出来的是一种线性关系，而与半乳糖醛酸含量的关系是非线性关系。方差分析结果（表3）表明，方程（1）的X1项回归系数和回归模型达到显著水平，X2项回归系数差异不显著；方程（2）的X1、项的回归系数和回归模型均达到显著水平，而其他项的回归系数差异不显著。由此可知，酸浓度是影响粗果胶产率和半乳糖醛酸含量的主要因素，而且它与料液比的交互作用较弱。另外，方程（1）和方程（2）的失拟p值分别为0.118 3和0.070 1，均大于0.05，都没有失拟，说明两个拟合方程的可信度较好。

表2 响应面实验方案与结果†Table 2 Scheme and experimental results of response surface methodology

表3 果胶粗产率和半乳糖醛酸含量的响应面模型及其回归系数（编码制）的方差分析†Table 3 Response surface model and ANOVA for coded regression coefficients both GalA content and extraction ratio of gross pectin

从果胶粗产率和半乳糖醛酸含量的响应面三维图（图5、图6）可以看出，果胶粗产率随着酸浓度增加和料液比降低而增加，在酸浓度3.91%（+1.414）、料液比1∶40（+1）时的果胶粗产率最高可达36.20%；半乳糖醛酸含量的变化却呈相反趋势。上述变化趋势可能是因为随着酸浓度及其体积的增大，狐臭柴叶片中的可溶性糖、无机离子等被大量酸解出来，沉淀过程中它们和果胶一起凝胶并析出，从而使果胶粗产率增加而半乳糖醛酸含量相对减少。然而，有效产率的数学模型测试结果却是一个平均值模型，即Y3=8.76%，与单因素实验和正交实验结果有矛盾之处，这很可能与半乳糖醛酸的不完全沉淀有关。

图5 果胶粗产率的3D响应面Fig. 5 Three-dimensional diagram of response surface on extraction ratio of gross pectin

通过综合分析酸浓度和料液比对响应值（Y1、Y2、Y3）的影响，本实验筛选出狐臭柴叶片果胶提取的优化条件为柠檬酸浓度为3.91%、料液比为1∶44.09，此时果胶粗产率、半乳糖醛酸含量、果胶有效提取率分别为36.72%、32.09%和11.78%。

图6 半乳糖醛酸含量的3D响应面Fig. 6 Three-dimensional diagram of response surface on GalA content

3 讨 论

响应面法是通过一系列确定性的“试验”拟合一个响应面来模拟真实极限状态曲面，其基本思想是通过近似构造一个具有明确表达形式的多项式来表达隐式功能函数[18]。本质上说，响应面法是一套统计方法，用这种方法来寻找最佳响应值，它能在曲面上直观地表现出优化区域，因此在工艺优化[19-24]方面表现出很好的优势。本研究的响应面优化结果显示，无论是果胶粗产率的线性模型还是半乳糖醛酸含量的二元二次方程模型的模拟效果都比较合理。单因素和正交实验结果均证明，在一定的酸浓度和料液比范围内，增加酸浓度和降低料液比可使半乳糖醛酸的提取率（果胶有效提取率）增加，但其响应面分析的结果却是个平均值模型，这显然有相悖之处，其中的差别可能是因提取流程延长所引起，因为响应面分析法提取果胶的流程中增加了乙醇沉淀等步骤，沉淀不完全或收集过程中的损失，最终都会影响有效提取率。不同浓度的柠檬酸处理后，其酸解液的pH也有差别，由此也会影响半乳糖醛酸的沉淀效果。Kalapathy等[21]对大豆皮果胶沉淀条件的探讨结果表明，当沉淀液的pH为3.5时，果胶沉淀率最高，pH过高或过低均会影响其沉淀效果。另外，果胶酯化程度也可能影响凝胶沉淀效果，因为酯键可改变果胶分子间的交联结构，高酯化度果胶通过半乳糖醛酸残基形成的氢键和甲氧基之间的疏水相互作用交联形成凝胶，而低酯化度果胶凝胶的分子基础是羧基结合Ca2+等无机离子而形成交联区，其中无机离子发挥了中介离子的作用[22]。因此，果胶酯化度也可能是影响果胶沉淀效果不可忽略的因素。宁海凤等[23]采用超声波协同酸解的方法对果胶提取条件的实验结果认为，超声波协同酸解处理可以缩短提取时间并增强提取效率。此外，在沉淀步骤之前对酸解液进行一定程度的浓缩，对于原料的利用可能会更加经济，这方面值得进一步研究。

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Preliminary study on pectin extraction in leaves of Premna puberula Pamp.

LI Xiang-dong, ZHANG Ming-sheng, LIU Shi-ya
(Guizhou Key Lab. of Propagation and Cultivation in Medicinal Plants, College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Citric acid was used to extract the pectin ofPremna puberulaleaves. Through single factor experiments and orthogonal design,the extraction process was studied involving four factors (acid concentration, extracting temperature, solute/solvent ratio and extracting time). The response surface methodology (RSM) was used to optimize the process of pectin extraction. The results show that the acid concentration and solute/solvent ratio were two key factors affecting pectin extraction ratio; within a certain range, acid concentration and pectin crude yield (Y1) was a positive linear correlation, solute/solvent ratio and pectin crude yield (Y1) was a negative linear correlation,the relationship both acid concentration and solute/solvent with galacturonic acid (GalA) content (Y2) of the crude pectin accorded with the model of binary quadratic polynomial equation; and GalA content had a downward trend with increase of acid concentration and decrease of solid-liquid ratio; the fi tting effect of GalA extraction ratio (pectin effective extraction ratioY3) was an average model, i.e.Y3= 8.86%;the pectin crude yield, GalA content and pectin effective extraction ratio were respectively 36.72%, 32.09% and 11.78% at 90℃ (extracting temperature), 120 min (extracting time), acid concentration 3.91% and solute/solvent ratio 1∶44.09.

Premna puberulaPamp.; pectin; galacturonic acid; extracting condition

S789.2

A

1673-923X(2014)10-0127-05

2013-09-19

贵州省教育厅自然科学研究项目（黔教科[2011]043号）；贵州大学研究生创新基金（农科2012008）；贵州省“科技兴村行动”计划项目（黔组通[2008]66号）和贵州省中药材现代产业技术体系建设项目（GZCYTX-02）资助

李祥栋（1987-），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向为植物生理与分子调控

张明生（1963-），男，重庆人，博士，教授，博士生导师，研究领域为植物生物技术与次生代谢调控；

E-mail：mszhang@gzu.edu.cn

[本文编校：文凤鸣]