石榴皮提取物抑菌与抗氧化作用研究

王丹苗，黄炳钰，张兴超，袁高峰(浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022)

据报道，全球每年由于腐败变质而造成约有10% ～20%的食品损失，其造成的经济损失是十分惊人的。因此保证食品的品质、防止食品及原料腐败变质是食品工业的重要任务。人们通常往食品中添加防腐剂来延长食品的保质期，由于该方法操作简便有效且应用广泛，故其仍为食品防腐保鲜的重要手段之一。当前，国内外多用如山梨酸、苯甲酸、对羟基甲酸脂等化学合成的防腐剂，其防腐效果好、价格较低，因而在食品加工中应用广泛。但同时发现这些防腐剂防腐效果不仅受到溶解度、pH、食品微生物等的限制影响，而且在一定程度上对食用口感、人们身体健康有不良影响，容易引起食物中毒，甚至致癌致畸等问题。越来越多的研究表明，人工合成化合物已引起了一系列的环境问题。故开发广谱、高效、安全且经济的新型天然防腐剂一直是食品科学、生物化学领域的重要课题［1］。

石榴皮是石榴的干燥果皮，除了含有大量多元酚、鞣质、有机酸、甾醇、黄酮类等活性物质外，还含有树脂蜡、糖、氨基酸等［2］。石榴皮多酚是石榴皮中多酚羟基化合物的总称，包括鞣花单宁、单宁、鞣花酸和没食子酸等多种化合物，Ahmad等研究证实，植物多酚、单宁和类黄酮具有广泛的抗菌活性［3］。石榴皮多酚中含有的鞣质类和黄酮等具有较强的抗氧化作用，如鞣花酸可与金属离子螯合，并与自由基反应，从而具有抗氧化功能［4］。美国科学家已证实石榴皮提取物对某些致病菌有抑菌活性［5］。笔者以石榴皮为原料制备石榴皮提取物，研究石榴皮提取物对食品中常见菌如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性和抗氧化活性，以期为石榴皮等加工副产物的应用提供一定的理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料 原料:石榴皮干制品，购于安徽;菌种:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，浙江海洋学院微生物实验室提供。

1.2 提取物制备 将粉碎的石榴皮用20倍的80%甲醇溶液在40℃水浴锅中溶解4 h，再用0.45 μm滤纸过滤。滤渣用相同量的80%甲醇溶液再提取2次，时间缩短为2 h和1 h，将全部提取液混合，使用旋转蒸发仪(40℃)减压浓缩滤液，恒温干燥12 h得到成品。

1.3 石榴皮提取物抑菌直径测定 先测定菌液浓度，在无菌条件下，将菌液稀释成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9倍，用移液枪(1 000 μl)分别吸取 1 ml于无菌培养皿上，并将菌液摇开，分别倾倒20 ml已配制好的熔融状态的固体培养基(约40℃)，充分摇匀，待凝固，倒置于培养箱(37℃)中。每个浓度梯度3次重复操作，并设置一份无菌蒸馏水做空白对照。待24 h后取出，取可计数的梯度进行计数，按以下公式确定菌液浓度:

式中，C为菌液浓度(CFU/ml);M为可计数平皿菌落平均个数;N为菌液稀释倍数。

将石榴皮提取物冻干粉用80%甲醇按梯度稀释配制成浓度为 0.800、0.400、0.200 、0.100、0.050、0.025 g/ml，相应标记备用。无菌条件下，分别吸取1 ml 2种菌悬液加入灭菌培养皿中，与约20 ml融化的固体培养基混匀。在待其培养基凝固前，用灭过菌的镊子将无菌牛津杯放置平板培养基的相应位置，待凝固，将牛津杯取出，并将牛津杯中的残留培养基取出，形成直径约8 mm的孔，往每孔注入20 μl提取物，每组3个平行试验，用80%甲醇做空白对照，平放于37℃培养箱中培养24 h。之后观察并用直尺测量抑菌圈的直径，记录并取其平均值。由此判断石榴皮甲醇提取物对这2种细菌的抑制效果。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 将石榴皮提取物用无菌蒸馏水配制成浓度为 2.000、1.500、1.000、0.500、0.250、0.125、0.050 mg/ml的梯度溶液。用移液枪分别吸取2 ml这7个浓度梯度的溶液注入灭菌培养皿中，加入熔融的培养基，充分混匀，待凝固，移取2种菌悬液各0.1 ml，用已灭菌涂布棒迅速抹匀，置恒温培养箱28℃中培养10 d，观察细菌生长情况。无菌落生成的最大稀释浓度为MIC。

1.5 样品多酚含量测定 准确称量真空干燥至恒重的没食子酸44.4 mg，用蒸馏水溶解并定容100 ml。将此溶液分别配制成浓度为 37.0、44.4、88.8、111.0、148.0 μg/ml溶液。分别移取上述各浓度溶液1 ml至10 ml比色管中，再分别加入0.5 ml福林 －酚试液，1 ml去离子水，2 ml 26.7%碳酸钠溶液，用去离子水定容至10 ml，振荡混匀，置室温下反应2 h，以空白做参比，在波长765 nm处测定吸光度，重复2次，制作多酚类测定标准曲线。将真空干燥过的石榴皮甲醇提取物用水溶解，浓度接近为0.08 mg/ml，取1 ml该浓度试液至10 ml比色管中，加1 ml去离子水，0.5 ml福林 －酚试液，2 ml 26.7%碳酸钠溶液，加去离子水定容至10 ml，在波长765 nm处测定吸光度［6］。将测得的吸光度代入标准曲线，求得多酚含量。

1.6 羟自由基清除能力测定 将石榴皮甲醇提取物配制成1 mg/ml溶液，再稀释成适当浓度进行测定。取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1 ml，PBS缓冲液2 ml和蒸馏水1 ml，充分混合后，加0.75 mmol/L硫酸亚铁1 ml混匀，加0.01%的H2O21 ml，在37℃下放置60 min，于波长536 nm处测其吸光度，其值为Ap。同上述步骤，其中用1 ml无水甲醇代替1 ml H2O2，测得的吸光度为Ab;用1 ml的试样液代替第一步骤中的1 ml蒸馏水，测得吸光度为AS。计算羟自由基清除率(D%)［7］:

1.7 超氧阴离子自由基(O－2·)清除能力测定 取0.05 mol/L，pH 8.2 的 Tris-HCl缓冲液 4.5 ml于试管，水浴(25℃)预热20 min，加入样品 0.1 ml，2.5 mmol/L 邻苯三酚 0.4 ml，混匀后在水浴(35℃)反应4 min，立即加2滴8 mmol/L的HCl终止反应，使用紫外－可见分光光度计在波长(299±1)nm处测定吸收度。使用0.1 ml蒸馏水作为空白组，按下面公式计算清除率［8－9］:

式中，AC为空白组的吸光值，AS为试验组的吸光值。

1.8 DPPH·清除能力测定 取一定浓度石榴皮甲醇提取物0.1 ml，加入3 ml 0.04%DPPH溶液，混匀后立即用分光光度计于波长为517 nm室温下，30 min内测量吸光度，读取稳定值。空白组为1 ml无水甲醇即测定用无水甲醇替代样品液后的吸光度［10］。计算公式如下:

式中，ODS为试验组在波长517 nm处的吸光度，ODC为空白组的吸光度。

2 结果与分析

2.1 石榴皮提取物抑菌活性 由图1和表1可以看出，石榴皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用，并且随着石榴皮甲醇提取物浓度的增大，抑制作用增强，当浓度升高到一定程度，抑制作用趋于稳定。

石榴皮提取物对金黄色葡萄球菌在浓度0.025～0.800 mg/ml的抑菌圈直径均比大肠杆菌大，说明该提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比大肠杆菌明显。

图1 石榴皮提取物抑菌效果

2.2 石榴皮提取物最小抑菌浓度测定 由表2可以看出，石榴皮提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.250 mg/ml，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.500 mg/ml。相同条件下，最小抑菌浓度越小，其抑菌活性越强。即表明石榴皮提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于对大肠杆菌的抑制效果。笔者的研究证实，石榴皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌效果，可考虑将其作为食品防腐剂加入食品中，以期达到抑菌的目的。

表1 不同浓度下的石榴皮提取物的抑菌圈直径

表2 最小抑菌浓度测定

2.3 石榴皮提取物多酚含量和抗氧化活性分析 试验得出，石榴皮提取物富含多酚，其含量达191.4 mg/g。研究已表明，天然提取物如葡萄籽提取物等含有的多酚对细菌具有抑制作用，该研究中石榴皮提取物具有的抑菌效果也可能与其富含多酚有关。

另外，试验得出，石榴皮甲醇提取物对溶液体系中反应产生的羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基·)具有一定的清除作用。随石榴皮甲醇提取物浓度的增加，其清除能力也随之增强。同一体系中，可用半抑制浓度IC50(·OH)来表示石榴皮甲醇提取物的除羟自由基能力的大小。半抑制浓度越小，则表明其清除自由基的能力越强。试验得到的石榴皮甲醇提取物清除羟自由基的IC50(·OH)=0.58 mg/ml，清除超氧阴离子自由基 IC50·)=0.65 mg/ml，IC50(DPPH·)=0.63 mg/ml。由此看出，该提取物对羟自由基的清除作用最强。

3 结论与讨论

该研究以石榴皮为材料制备石榴皮甲醇提取物，研究石榴皮提取物对食品中常见细菌如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果，研究石榴皮提取物多酚含量和抗氧化活性。试验得出以下结论:石榴皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用较好，石榴皮甲醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为24.5和21.5 mm。金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为0.250 mg/ml、大肠杆菌最小抑菌浓度为0.500 mg/ml。石榴皮提取物多酚含量为191.4 mg/g。石榴皮甲醇提取物对羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基·)和DPPH·的 IC50分别为 0.58、0.65、0.63 mg/ml。很明显该提取物对羟自由基的清除作用最强。

该研究仅对石榴果皮甲醇提取物的抑菌活性进行了研究，其他部位不同溶剂提取物仍需要进行抑菌活性测试，以此来明确石榴其他部位的提取物抑菌活性强弱。同时还对提取物的抗氧化性进行初步测定。这些有助于增进对将来开发无害有效的新型天然防腐剂和抗氧化剂的了解，并对这些新型添加剂进行相应的毒理评价，应用于食品保藏技术中，使人们食用更绿色安全、放心可靠的食品。

目前在食品中一直沿用直接在食品中添加防腐剂，但为了提高防腐剂的使用效果，将来可以改善单一的添加方式，结合新型的技术，如与物理场强强化技术相结合、采用外控气相抑菌技术等，进而实现以提高食品质量、降低加工成本、研发和利用高效多功能类型防腐剂的目标。我国分布着许多拥有优良石榴品种和栽培条件的种植基地，产量可观［11］，石榴皮为石榴加工的下脚料，属于农副产品的废弃物，来源广泛，价格低廉，对环境基本不会造成污染和其他负面影响。从目前研究状况可知，石榴皮中存在多种生物活性物质，这些天然物质不仅具有强抗氧化活性，而且在抑菌方面显得非常出色，这些优点使得其在今后的食品反腐保鲜中应用前景广阔。

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