女贞子酒抗氧化活性及相关成分浸出率测定*

戴一，宋祖荣，夏莲凤，朱建

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥，230088)

女贞子(Fructus ligustri Lucidi)是木犀科女贞属植物女贞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果实，资源丰富，在中国长江流域及南方各地、河南、陕西、甘肃等地均有分布。女贞子主要含有萜类［1-2］、黄酮［3］及多糖等成分。其中所含黄酮成分主要为芹菜素、木樨草素、芹菜素及其苷等，这些黄酮成分具有保护心血管、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗肿瘤等作用［4-5］。女贞子为药食两用植物果实，具有滋补肝肾，乌须明目之功效［6］。民间用其泡酒，具体制法为取冬季成熟果实，洗净，蒸煮晒干后取200 g，放入500 mL低度白酒中，加盖密封，每天振摇1次，1周后开始服用，每日1～2次，每次1小盅。因补益肝肾，抗衰祛斑多与氧化相关，而植物中黄酮成分常具有较强的抗氧化活性，且文献未见有关女贞子酒抗氧化活性研究及抗氧化作用的相关黄酮含量的测定，同时也未见白酒酒精度对女贞子抗氧化物质浸出率的研究报道，因此研究白酒酒精度对女贞子酒抗氧化活性的影响及相关黄酮成分含量测定对于科学饮用女贞子酒具有重要参考价值，也为女贞子的综合利用提供参考。本实验将10%、20%、30%和40%四种不同酒精度的女贞子酒，浓缩干燥得提取物，采用DPPH法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法研究水提取物对DPPH·、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除作用，并测定不同酒精度女贞子酒中抗氧化成分的浸出率，同时采用HPLC测定2种重要黄酮成分木犀草素和芹菜素的浸出率，为女贞子的进一步研究与开发利用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪，安捷伦1260 MWD检测器，安捷伦1260二元泵，美国安捷伦科技公司;UV-4802S型紫外可见分光光度仪，尤尼柯(上海)仪器有限公司;AB135-S电子分析天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司;FA2004型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司;移液器，德国Eppendorf股份公司。

1.2 试药女贞子药材

女贞子，购自于亳州药材市场(由本校中药鉴定教研室庆兆老师鉴定为女贞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果实);DPPH(批号:132805)，(天津西玛科技有限公司;芹菜素对照品，天津一方科技有限公司;木犀草素对照品，天津一方科技有限公司;甲醇为色谱纯，乙醇、三氟乙酸、Al(NO3)3、NaNO2、水杨酸、FeSO4、双氧水、NaOH、无水乙醇等试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 女贞子酒抗氧化活性实验

采用DPPH法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法来进行抗氧化实验，并以样品的浓度与其对应的自由基清除率采用origin8.0作图，从中读取EC50［7-8］。

2.1.1 女贞子酒浸膏的制备

称取女贞子粉末40 g，用200 mL不同酒精度的白酒进行浸提，每天振摇3 min，浸提1周后抽滤，滤液蒸干后40℃真空干燥48 h，称重计算得膏率后备用。精密称取女贞子酒提取物浸膏配制成高中低7个浓度溶液。

2.1.2 DPPH·的清除实验

精确称取5 mg DPPH，用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，配制成0.05 mg/mL的DPPH溶液，于0～4℃避光保存，备用，将样品原液精确地配制成系列浓度的溶液。分别取样品溶液5 μL，加水至3.5 mL，加DPPH溶液2.5 mL均匀混合，于黑暗中放置30 min，在517 nm处测定其吸光度值Ai;同时测定3.5 mL水加2.5 mL DPPH溶液的吸光度A0;样品溶液5 μL，加水至3.5 mL，加2.5 mL甲醇的吸光度 Aj;以2.5 mL甲醇加3.5 mL水做空白对照进行测定。

2.1.3 ·OH的清除实验

在试管中加入不同浓度的样品溶液0.1 mL，6 mmol/L水杨酸-乙醇 0.5 mL，6 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，最后加入0.5 mL 0.1%H2O2，总体积5 mL，以双蒸水补足体积。其中对照管不加样液，样底管不加H2O2，摇匀后启动反应，37℃ 水浴反应30 min，以蒸馏水作参比，在510 nm下测定各样品溶液的吸光度。计算·OH的清除率。

A样品为加入女贞子酒提物溶液后的羟自由基体系的吸光度值;A对照为不加女贞子酒提物溶液的羟自由基体系的吸光度值;A样底为羟自由基体系中不加H2O2而加女贞子酒提物溶液的吸光度值。

2.1.4 O2-·的清除实验

取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)4.5 mL于试管中，分别加入1 mL不同浓度的样品溶液，于25℃水浴中预热20 min，再加5 mmol/L邻苯三酚溶液(或10 mmol/L HCl溶液)0.4 mL，摇匀后25℃水浴中准确反应5 min，后迅速加入1 mL 8 mol/L HCl终止反应，在波长420 nm处测吸光度Ai或Aj;同时测定不加样品溶液的反应体系获得Ao;测定以4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)、1.4 mL水及1 mL 8 mol/L HCl混合液为空白对照，计算清除率。

2.2 女贞子酒中总黄酮测定

2.2.1 标准曲线绘制

精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品10.1 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(1 mL含芦丁0.404 mg)。精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置25 mL 量瓶中，各加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，使混匀，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1mL，摇匀，放置6 min，加NaOH试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以甲醇溶液为空白对照在500 nm波长处测定吸收度。以质量浓度(C)对吸光度值(A)作回归统计分析［9］。

2.2.2 供试品溶液制备

精密称取女贞子粉末5.00 g，4份，分别加10%、20%、30%和40%乙醇定容到25 mL容量品中，每天振摇3 min，浸提7天，微孔滤膜过滤，滤液用于总黄酮测定及HPLC分析。

2.2.3 总黄酮测定

取供试品溶液0.1 mL置25 mL容量瓶中，加蒸馏水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，使混匀，放置6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加浓度为4.0%的NaOH试液10 mL，蒸馏水定容至25 mL，摇匀，放置15 min，在500 nm波长处测定吸收度。根据回归方程计算女贞子酒中总黄酮浸出率。总黄酮浸出率即女贞子酒中每1 g药材总黄酮浸出的量(mg)。

2.3 木犀草素、芹菜素HPLC含量测定

2.3.1 HPLC分析条件

色谱柱:Agilent HC-Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 -0.2%三氟乙酸(53∶47，v/v);流速1.0 mL/min，检测波长350 nm;柱温25℃;进样量 20 μL［10］。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取木犀草素和芹菜素各5.00 mg分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，并从中取1 mL定容至10 mL，制成木犀草素和芹菜素浓度均为0.05 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 线性关系考察

精密吸取木犀草素和芹菜素混合对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 加甲醇定容至 10 mL，摇匀。精密吸取混合对照品溶液20 μL按2.3.1中的色谱条件进行分析，测定色谱峰峰面积，分别以色谱峰面积(A)对质量浓度(C)绘制标准曲线。

2.3.3.2 精密度实验

取同一质量浓度的木犀草素和芹菜素混合对照品溶液，重复进样6次，每次进样20 μL，计算峰面积的RSD。

2.3.4.3 重现性实验

精密称取同一女贞子粉末样品5.0 g，6份，按2.2.2项下方法操作，制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件测定各样品的峰面积，计算木犀草素和芹菜素浸出率的RSD值。

2.3.3.4 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12 h 按2.3.1项下色谱条件下进样分析，计算木犀草素和芹菜素浸出率的RSD。

2.3.3.5 回收率实验

精密称取9份已测定木犀草素和芹菜素含量的药材5.0 g，按所含两黄酮量的80%、100%和120%比分别加入对照品，每个加样比做3次实验，取制成供试品溶液稀释1倍后进行分析，计算木犀草素、芹菜素的平均回收率。

2.3.4 样品测定

取女贞子酒供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件下分析，测定峰面积，计算女贞子酒中木犀草素及芹菜素浸出率。浸出率即女贞子酒中每1 g药材木犀草素或芹菜素浸出的量(μg)。

3 结果与分析

3.1 女贞子酒浸膏得率研究

通过平行3次实验，研究不同酒精度白酒对女贞子提取率的影响，得不同酒精度下女贞子浸膏得率，结果见表1。可见随着酒精度的增加，浸膏得率呈逐渐升高趋势，40%乙醇浸泡得膏率最高，为20.35%。

表1 女贞子酒提取得膏率Table 1 Yield of the total extract from Nvzhenzi wine

3.2 女贞子酒抗氧化活性实验

3.2.1 DPPH·的清除实验

通过对7个不同浓度的女贞子酒提取物溶液进行DPPH·的清除实验，发现随着酒精度的增加，女贞子酒提取物清除率逐渐升高，尤其在前3个浓度点，清除率随浓度变化急剧增大，清除率约达到70%后，随浓度的增加而较为缓慢，其EC50值的大小顺序为40%酒精度女贞子酒(EC50为12.75 mg/mL)＜30%酒精度女贞子酒(EC50为14.60 mg/mL)﹤20%酒精度女贞子酒(EC50为14.71 mg/mL)﹤10%酒精度女贞子酒(EC50为15.96 mg/mL)。可见40%酒精度女贞子酒DPPH·的清除活性最强，见图1。

图1 不同浓度女贞子酒提取物对DPPH·清除作用Fig.1 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on DPPH·free radical

3.2.2 ·OH的清除实验

通过对7个不同浓度的女贞子酒提取溶液进行·OH的清除实验，发现不同酒精度女贞子酒提取物在50～200 mg/mL范围内清除率逐步增加，30%酒精提取物的清除率与浓度成较好的线性关系，清除率较高的为40%及30%酒精提取物，其EC50值的大小顺序为40%酒精度女贞子酒(EC50为62.86 mg/mL)﹤30%酒精度女贞子酒(EC50为96.81 mg/mL)﹤20%酒精度女贞子酒(EC50为114.04 mg/mL)﹤10%酒精度女贞子酒(EC50为122.41 mg/mL)。可见40%酒精度女贞子酒·OH的清除活性最强，见图2。

3.2.3 O2-·的清除实验

通过对7个不同浓度的女贞子酒提取溶液进行O2-·的清除实验，发现不同酒精度女贞子酒提取物均随着浓度的增加，清除率也是逐渐升高，尤其在前5个浓度点，清除率随浓度变化急剧增大，其EC50值的大小顺序为40%酒精度女贞子酒(EC50为15.93 mg/mL)﹤20%酒精度女贞子酒(EC50为20.75 mg/mL)﹤30%酒精度女贞子酒(EC50为21.76mg/mL)﹤10%酒精度女贞子酒(EC50为28.04 mg/mL)。可见40%酒精度女贞子酒O2-·的清除活性最强，见图3。

图2 不同浓度女贞子酒提取物对·OH清除作用的影响Fig.2 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on·OH free radical

图3 不同浓度女贞子酒提取物对O2-·清除作用Fig.3 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on O2-·free radical

3.3 女贞子酒中总黄酮测定

3.3.1 标准曲线绘制

对6个不同浓度点的芦丁对照品进行铝盐法显色后500 nm测定吸光度。以质量浓度(C)对吸光度值(A)作回归统计分析。回归方程为:Y=13.771X-0.050 4(R2=0.999 4)，表明芦丁在0.016 2～0.097 0 mg/ml范围内线性关系良好。

3.2.2 总黄酮测定

对4个梯度酒精度女贞子酒进行总黄酮测定。根据回归方程计算女贞子酒中总黄酮浸出率结果见表2，可见随着酒精度的提高，女贞子酒中的总黄酮浸出率亦呈增高趋势，黄酮成分多具有较多的酚羟基，具有抗氧化活性，与前述抗氧化活性的顺序吻合。

3.3 女贞子酒中木犀草素和芹菜素浸出量测定

3.3.1 标准曲线的绘制

对5个不同浓度点的木犀草素和芹菜素混合对照品溶液进样分析后，以浓度(C)对峰面积(A)绘制标准曲线，得木犀草素和芹菜素回归方程分别为A=74.919C-29.98，R2=0.999 8;A=80.208C-36.41，R2=0.999 6，二者分别在3.35 ～16.75 μg/mL和2.45～12.25 μg/mL质量浓度范围呈良好的线性关系。色谱图见图4。

表2 女贞子酒中总黄酮浸出率Table 2 The extraction rates of total flavonoids in Nvzhenzi wine

图4 木犀草素和芹菜素混合对照品HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of standard

3.3.2 精密度实验、重现性、稳定性实验

同一质量浓度的木犀草素和芹菜素混合对照品溶液进样6次分析后，木犀草素和芹菜素峰面积RSD分别为1.03%和1.41%，表明精密度良好，见表3。对6份制备的女贞子酒供试液测定后，木犀草素和芹菜素浸出率的RSD值分别为1.41% 和1.47%，表明具有较好重现性，见表4。对于0、2、4、6、8、10 h 后进样分析的同一供试液，木犀草素和芹菜素峰面积的RSD分别为0.94%和0.99%，表明供试品溶液在10 h内稳定，见表5。

表3 精密度实验Table 3 Precision experiments

表4 重复性实验Table 4 Pepeatability experiments

3.3.3 回收率实验

9份药材经加样制备供试液进行HPLC分析，其结果见表6、表7。木犀草素和芹菜素的回收率分别在97.88% ～98.33%和97.88% ～99.40%之间，RSD值均小于1.5%。

表5 稳定性实验Table 5 Stability experiments

表6 木犀草素回收率实验Table 6 Method recevery of luteolin

3.3.4 女贞子酒中木犀草素和芹菜素浸出量测定

对3份女贞子酒提取物进行HPLC分析，供试液色谱图为图5，由图可见随着女贞子酒精度的降低，木犀草素和芹菜素浸出量明显下降，当酒精度为10%时2种成分几乎无峰出现，可见酒精度的高低影响着女贞子酒中黄酮成分含量。

表7 芹菜素回收率实验Table 7 Method recevery of apigenin

图5 女贞子酒提取物HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of Nvzhenzi wine extract

具体结果见表7，随着酒精度的升高女贞子酒中木犀草素和芹菜素的进出量明显升高，表明女贞子酒中含有较丰富的木犀草素和芹菜素，并可能与其相应的抗氧活性升高有关。

表7 女贞子酒中木犀草素和芹菜素的浸出率Table 7 The extraction rates of luteolin and apigenin in Nvzhenzi wine

4 结论

氧化损伤与多种疾病如衰老、癌症及心血管疾病等相关［11］，女贞子酒具有较高的保健价值，通过DPPH法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法研究发现女贞子酒提取物对DPPH·、·OH和O2-·有明显的清除作用，且随着女贞子酒精度的增高，其提取物对3种自由基的清除作用明显增强，同时女贞子酒中总黄酮及木犀草素和槲皮素的浸出率也表现出和相同的趋势即随着酒精度的升高而升高，说明女贞子酒的抗氧化活性可能与其所含黄酮成分密切相关。40%酒精度女贞子酒提取物表现出最强的自由基清除活性，对DPPH·、·OH和O2-·的EC50值分别为12.75、62.86和15.93 mg/mL，此时女贞子酒中总黄酮、木犀草素和芹菜素的浸出率分别为21.96 mg/g、40.07 μg/g和28.99 μg/g，可见女贞子酒的浸泡，应选择较高的酒精度，也为其进一步开发提供了依据。

［1］ HUANG XJ，WANG Y，YIN ZQ，et al.Two new dimeric secoiridoid glycosides from the fruits of Ligustrum lucidum［J］.J Asian Nat Prod Res，2010，12(8):685-690.

［2］ Aoki S，Honda Y，Kikuchi T，et al.Six new secoiridoids from the dried fruits of Ligustrum lucidum［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2012，60(2):251-256.

［3］ 徐小花，杨念云，钱士辉，等.女贞子黄酮类化合物的研究［J］.中药材，2007，30(5):538-540.

［4］ 张芳芳，沈汉明，朱心强，等.木犀草素抗肿瘤作用的研究进展［J］.浙江大学学报(医学版)，2006，35(5):573-578.

［5］ 王海娣，刘艾林，杜冠华.芹菜素药理作用的研究进展［J］.中国新药杂志，2008，17(18):1 561-1 565.

［6］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:43.

［7］ 陆武祥，王东华，王秀英，等.5种食用菌液体发酵菌丝抗氧化活性分析比较［J］.食品与发酵工业，2013，39(7):124-127.

［8］ 王锐，何嵋，袁晓春，等.木蝴蝶总黄酮的抗氧化活性［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(23):102-105.

［9］ 朱艳琴，殷勤红，杨俊，等.超声醇溶-紫外分光光度法测定不同产地三七花中总黄酮含量［J］.食品与发酵工业，2013，39(1):187-189.

［10］ 蔡熠，郁颖佳，归靓，等.微波辅助萃取-高效液相色谱法测定金银花药材中槲皮素和木樨草素的含量［J］.中国临床药学杂志，2010，19(4):236-239.

［11］ 陈刚领，刘俊，卞卡.蛋白质特殊氧化与疾病关系的研究进展［J］.中国药理学通报，2009，25(5):561-565.