黄秋葵花体外清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究*

朱艳芳，杨杰，刘东华，张爱民，薛建平，滕井通，盛玮

1(淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北，235000)

2(资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北，235000)

3(昆山东海农业发展有限公司，江苏昆山，215301)

黄秋葵［Abelmoschus esculentus(L.)Moench］为锦葵科秋葵属1年生草本植物，又名秋葵、咖啡黄葵、补肾草等，原产于非洲热带地区，现在我国大陆南北方各地均有黄秋葵的种植。可供食用的黄秋葵嫩果，富含蛋白质、黄酮、多糖、不饱和脂肪酸、维生素等多种生物活性物质［1-2］，具有抗疲劳、提高机体免疫力、抗癌、健胃保肝、减少肺损伤、利尿、增强血管扩张力、保护心脏等多种保健功能［3-5］，是一种有巨大发展潜力的营养保健蔬菜［6-8］。

食物中硝酸盐和亚硝酸盐的含量与人类健康关系密切，其中人体摄入的硝酸盐约70% ～80% 来自于蔬菜，1% 来自水果［9］。硝酸盐自身对人体危害不大，但它在人或动物体内易被还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐又能与次级胺合成N-亚硝胺，尤其在胃液中更易合成。亚硝胺是目前所知的最强的化学致癌物质之一，能引起人和动物胃、肝脏等多种脏器的恶性肿瘤［10-11］。所以，多采用在模拟人体胃液条件下，通过研究天然植物成分清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的能力，来确定该植物的抗癌能力及食用价值。

目前种植黄秋葵主要出售嫩果，其种子及花没有被充分利用，而种子和花中富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、多糖、黄酮［12-13］等活性物质。因此，本文在体外模拟人体胃液环境下，对黄秋葵花清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成进行了初步探究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄秋葵花，由昆山市东海农业发展有限公司提供，60℃烘箱烘干，粉碎后过20目筛备用。

二甲胺水溶液(33%)，为化学纯;NaCl、浓 HCl、NaNO2、α-萘胺、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、Na2CO3、95%乙醇、VC，均为国药生产的分析纯;胃蛋白酶(3 500 u/mg)，购于Sigma公司。

模拟胃液A:称取2.0 g NaCl加蒸馏水溶解，加入7 mL浓HCl，用蒸馏水定容至1 000 mL;模拟胃液B:在模拟胃液A的基础上加入胃蛋白酶3.2 g，用蒸馏水定容至刻度。

NaNO2标准溶液:将NaNO2于硅胶干燥器中干操24 h后，称取0.400 0 g加水溶解，定容至1 000 mL，即得浓度为400 μg/mL的NaNO2储备液。取储备液12.5 mL定容至1L，即得浓度为5 μg/mL的NaNO2溶液，取储备液17.25 mL定容至100 mL，即得浓度为1 mmol/L的NaNO2溶液。

JA2003电子天平，上海良平仪器仪表有限公司;W21-420型三用电热恒温水浴锅，天津市秦斯特仪器有限公司;UV-4802型紫外可见分光光度计，尤尼科上海仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄秋葵花提取液的制备

准确称取10.00 g黄秋葵花，加200 mL 60%乙醇，60℃ 水浴浸提2 h后，过滤，收集滤液，再重复3次，将滤液定容至1 000 mL，并配成含有1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL黄秋葵花的提取液，备用。

1.2.2 黄秋葵花提取液对亚硝钠的清除率的测定［14-16］

取12只25 mL容量瓶，均加入模拟胃液10.0 mL，37℃ 水浴 10 min，分别加入 0、1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL黄秋葵花提取液1.0 mL，再加入5 μg/mL的NaNO2溶液2.0 mL，置于37℃的水浴锅中温浴，10、30、60 min后取出，迅速加入0.4% 对氨基苯磺酸2.0 mL，混匀，静置5 min后，各加1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，再静置15 min，加水至刻度混匀。在538 nm处测定吸光度A1，同时做以蒸馏水替代NaNO2的空白对照实验并测吸光度A01，以蒸馏水替代黄秋葵花提取液的空白对照实验测定吸光度A02。

亚硝酸盐清除率/%=［(A02+A01-A1)/A02］×100

1.2.3 黄秋葵花提取液对亚硝胺合成阻断率的测定［14-15］

在12只25 mL容量瓶中各加入模拟胃液10.0 mL，分别加入 0、1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL 黄秋葵花的提取液1.0 mL，各加入1 mmol/L二甲胺溶液1.0mL，1 mmol/L的NaNO2溶液1.0 mL，用蒸馏水定容至刻度。于37℃水浴锅中反应1 h。取出后，移液管吸取1.0 mL上述溶液至直径7 cm的培养皿中，加入0.5%Na2CO3溶液0.5 mL，紫外灯照射15 min。取出后迅速加入1%对氨基苯磺酸1.5 mL，0.1% α-萘胺1.5 mL，蒸馏水0.5 mL，摇匀后静置15 min。在525 nm处测定吸光度A1，同时做以蒸馏水替代亚硝酸钠的空白对照实验测定吸光度A01，以蒸馏水替代黄秋葵花提取液的空白对照实验测定吸光度A02。

亚硝胺合成阻断率/%=［(A02+A01-A1)/A02］×100

1.2.4 数据分析

所有试验均重复3次，实验数据使用Minitab15软件处理，进行一般线性模型分析与拟合线图分析。

2 结果与分析

2.1 黄秋葵花提取液对亚硝酸盐的清除

2.1.1 黄秋葵花浓度对亚硝酸盐清除率的影响

在模拟胃液A和B的2种反应体系中，分别加入不同浓度黄秋葵花的提取液，对NaNO2的清除效果如图1。由图1可知，黄秋葵花对亚硝酸钠的清除率呈现规律性变化，即随着黄秋葵花浓度的升高而增强，且在模拟胃液B中的清除效果优于模拟胃液A。当黄秋葵花为10 mg/mL的提取液，反应60 min时，在模拟胃液A和B两种体系中，对亚硝酸钠的清除率分别为98.26% 和99.36%，说明黄秋葵花提取液能有效清除亚硝酸盐。

图1 不同浓度黄秋葵花在A、B两种胃液中对亚硝酸盐的清除率Fig.1 The eliminating rate of nitrite by different concentration of Okra flower in two kinds of simulated human gastric juice

2.1.2 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

在模拟胃液A和B的反应体系中加入黄秋葵花提取液，不同反应时间黄秋葵花提取液对亚硝酸钠的清除效果如图2。由图2可知，黄秋葵花提取液对亚硝酸盐的清除率随着反应时间的延长而升高，且在模拟胃液B中的清除效果优于模拟胃液A。

2.1.3 黄秋葵花提取液清除亚硝酸盐结果分析

由表1可知，亚硝酸盐的清除率与黄秋葵花浓度及反应时间具有线性关系，清除率随着浓度的升高及反应时间的延长而增强;亚硝酸盐的清除率与不同模拟人体胃液也具有线性关系，且差异极显著。根据回归分析，见表2，R2表示清除率变异的77.7% 由反应浓度导致的，4.0% 由反应时间导致的，0.4% 由不同的模拟胃液导致的。

图2 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响Fig.2 Effects of reaction time on eliminating rate of nitrite

表1 亚硝酸盐清除率方差分析Table 1 Analysis of variance for the rate of eliminating nitrite

表2 亚硝酸盐清除率回归分析Table 2 Regression analysis for the rate of eliminating nitrite

2.2 黄秋葵花提取液对亚硝胺合成的阻断分析

在体外模拟胃液A和B的2种反应体系中，不同浓度黄秋葵花的提取液对亚硝胺合成的阻断效果如图3所示。由图3可知，随着黄秋葵花浓度的升高对亚硝胺合成的阻断率也升高。当黄秋葵花浓度为10 mg/mL时，在模拟胃液A和B反应体系中对亚硝胺合成的阻断率分别为70.29%和78.13%，说明黄秋葵花提取液能有效地阻断亚硝胺的合成。由表3可知，亚硝胺合成的阻断率与黄秋葵花的浓度有线性关系，阻断率随着浓度的升高而增强;亚硝胺合成的阻断率与不同模拟人体胃液也具有线性关系，且差异极显著。由回归分析可知(见表4)，R2表示阻断率变异的92.9% 由黄秋葵花浓度导致，1.1% 由不同模拟人体胃液所导致。

图3 不同浓度黄秋葵花对亚硝胺合成阻断率的影响Fig.3 Effects of extract from different concentrations of Okra flower on blocking rate of nitrosamine

表3 亚硝胺合成阻断率方差分析Table 3 Analysis of variance for the rate of blocking nitrosamine synthesis

表4 亚硝胺合成阻断率的回归分析Table 4 Regression analysis for the rate of blocking nitrosamine synthesis

2.3 黄秋葵花提取液与Vc在清除亚硝酸钠及阻断亚硝胺合成能力方面的比较

Vc具有较强的抗氧化能力，不仅对亚硝酸盐具有较强的清除能力，而且能有效阻断亚硝胺的合成［17］。因此以Vc为阳性对照，比较黄秋葵花提取液对亚硝酸盐的清除及阻断亚硝胺合成能力，结果见表5。由表5可知，5 mg/mL黄秋葵花的提取液，在胃液A和胃液B中，对亚硝酸盐的清除率分别为75.79% 和81.02%，与0.1 mg/mL Vc对亚硝酸盐的清除能力相当;对亚硝胺合成的阻断率分别为50.60% 和 54.24%，为 0.1 mg/mL Vc阻断率的55.16%和59.13%。表明在模拟人体胃液条件下，黄秋葵花提取液能有效地清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺的合成，揭示黄秋葵花具有一定的防癌抗癌功能。

表5 黄秋葵花提取液与Vc对亚硝酸盐的清除率及对亚硝胺合成阻断率的比较Table 5 The eliminating rate of nitrite and the blocking rates of nitrosamine synthesis with extract from Okra flower and Vc

3 结论

体外黄秋葵花能有效清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，且清除率和阻断率与黄秋葵花的浓度及作用时间成正相关。其中黄秋葵花的浓度对亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率的相关性较大。在添加了胃蛋白酶的模拟胃液B条件下，黄秋葵花提取液清除亚硝酸盐与阻断亚硝胺合成的效果均要好于模拟胃液A。在模拟胃液B中，5 mg/mL黄秋葵花的提取液作用10 min，对亚硝酸盐的清除率达到81.02%，对亚硝胺合成的阻断率达到54.24%。

黄秋葵花的提取液能有效地清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是预防癌症的有效途径。因此，黄秋葵花对防止癌症病因的产生及心脑血管疾病具有重要的价值。若将黄秋葵花用于花茶的开发利用，不仅可以提高黄秋葵种植的经济效益，而且将会有更大的社会效益。

［1］ 黄阿根，陈学好，高云中，等.黄秋葵的成分测定与分析［J］.食品科学，2007，28(5):451-455

［2］ 廖海兵.黄秋葵功效成分纯化鉴定及其在不同品种间差异研究［D］.杭州:浙江农林大学，2012

［3］ 李建华，陈珊.黄秋葵水提取液抗疲劳的药效学观察［J］.中国运动医学杂志，2004，23(2):196-197

［4］ 王君耀，周峻，汤谷平.黄秋葵抗疲劳作用的研究［J］.中国现代应用药学杂志，2003，20(4):316-317

［5］ 赵焕焕，贾陆，裴迎新.黄秋葵粗多糖体外抗氧化活性测定［J］.郑州大学学报:医学版，2012，47(1):40-43

［6］ 董彩文，梁少华.黄秋葵的功能特性及综合开发利用［J］.食品研究与开发，2007，28(5):180-182

［7］ 刘娜.黄秋葵的综合利用及前景［J］.中国食物与营养，2006，(6):27-30

［8］ 单承莺，马世宏，张卫明.保健蔬菜黄秋葵的应用价值与前景［J］.中国野生植物资源，2012，31(5):68-71

［9］ 庞荣丽，何为华，方金豹，等.几种果品中硝酸盐和亚硝酸盐的含量［J］.果树学报，2006，23(4):627-630

［10］ Lin J K.Nitrosamines as potential environmental carcinogens in man ［J］.Clinical Biochemistry，1990，2(1):67-71

［11］ Mohamed Mamary，Molham Habori，Zakaria Shoaibi，et al.Nitrosamine formation from different Catha edulis leaves extracts under simulated gastric condition［J］.Food Chemistry，2006，97(4):586-590

［12］ 詹忠根，李煜键，张宇.黄秋葵种子主要营养成分测定［J］.营养学报，2012，34(2):191-192

［13］ 胡帅，张骋，李强，等.不同黄秋葵花中总黄酮的提取和含量测定［J］.激光生物学报，2013，22(4):375-378

［14］ 李桂星，胡晓丹，孙爱东，等.模拟胃液条件下苹果多酚对亚硝酸盐的清除作用［J］.食品科学，2011，32(11):1-4

［15］ 梁英岳，傅亮，孙颖莺，等.模拟胃液条件下红豆多肽清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究［J］.食品与发酵工业，2010，36(4):40-44

［16］ 盛玮，高翔，薛建平，等.黑糯玉米色素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究［J］.食品科学，2013，34(17):92-95

［17］ 王树庆，姜薇薇，房晓，等.抗坏血酸的亚硝酸盐清除能力的研究［J］.中国调味品，2011，36(11):22-24