谈谈婴幼儿配方米粉中亚硝酸盐的检测

林旭彬

（广东东泰乳业有限公司，广东 揭阳 515500）

0 前言

婴幼儿配方米粉是将大米磨成粉，加入奶粉、白砂糖、维生素、微量元素等辅料经标准化、酶解、辊筒烘干、粉碎、装罐制成的，是一种婴幼儿谷类辅助食品。婴幼儿配方米粉产品的执行标准为GB10769—2010（食品安全国家标准 婴幼儿谷类辅助食品）；污染物限量指标项目亚硝酸盐在GB10769—2010 标准中规定采用GB5009.33—2010（食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定）进行检测，在GB 5009.33—2010 中第一法离子色谱法由于设备原因，大部分检验机构都采用第二法分光光度法和第三法乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定；再由于婴幼儿配方米粉产品不是乳制品，因此大部分检验机构都采用GB5009.33—2010 中的第二法分光光度法。下面是GB 5009.33—2010 中第二法分光光度法和第三法乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定法的检测。

1 实验部分

本实验所用本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。

1.1 分光光度法

1.1.1 原理

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。

1.1.2 试剂与设备

1）试剂及配制

（1）亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）。

（2）乙酸锌（Zn(CH3COO)2·2H2O）。

（3）冰醋酸（CH3COOH）。

（4）硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）。

（5）盐酸（ρ＝1.19 g/mL）。

（6）氨水（25 %）。

（7）对氨基苯磺酸(C6H7NO3S）。

（8）盐酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）。

（9）亚硝酸钠（NaNO2）。

（10）硝酸钠（NaNO3）。

（11）锌皮或锌棒。

（12）硫酸镉。

（13）亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取106.0 g 亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000 mL。

（14）乙酸锌溶液(220g/L)：称取220.0 g 乙酸锌，先加30mL 冰醋酸溶解，用水稀释至1000mL。

（15）饱和硼砂溶液(50g/L)：称取5.0 g 硼酸钠，溶于100mL 热水中，冷却后备用。

（16）氨缓冲溶液（pH9.6～9.7）：量取30mL 盐酸，加100mL 水，混匀后加65mL 氨水，再加水稀释至1000mL，混匀。调节pH 至9.6～9.7。

（17）氨缓冲液的稀释液：量取50mL 氨缓冲溶液，加水稀释至500 mL，混匀。

（18）盐酸(0.1mol/L)：量取5mL 盐酸，用水稀释至600mL。

（19）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4g 对氨基苯磺酸，溶 于100 mL 20 %（V/V）盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

（20）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g 盐酸萘乙二胺，溶 于100mL 水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存。

（21）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：准确称取0.1000g 于115℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（22）亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。

（23）硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取0.1232g 于115℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于入500mL 容量瓶中，并稀释至刻度。

（24）硝酸钠标准使用液（5μg/mL）：临用时吸取硝酸钠标准溶液2.50mL，置于100mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。

2）设备

天平（感量为0.1mg 和1mg）、组织捣碎机、超声波清洗器、恒温干燥箱、分光光度计、镉柱

3）试样预处理

将试样装入能够容纳2 倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。

1.1.3 试样处理

1）提取

称取5g（精确至0.01g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于50mL 烧杯中，加12.5mL 饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70 ℃左右的水约300mL 将试样洗入500mL 容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。

2）提取液净化

在振荡上述提取液时加入5mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL 乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用，同时做试剂空白。

3）亚硝酸盐的测定

①标准曲线的配制；取标准溶液（亚硝酸根NO2-）0.50 mL 于100mL 的容量瓶中定容，分别吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、1.00mL、2.00mL 亚硝酸钠标准使用液于50mL 比色管中，加入2mL 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min 后各加入1mL 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm 比色杯，以零管调零，于波长538nm 处测吸光度，绘制标准曲线。

②吸取40.0mL 上述滤液于置于50mL 带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min 后各加入1mL 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以试剂空白管调零，于波长538nm 处测吸光度，根据标准曲线读数。按公式计算含量。

1.2 乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定

1.2.1 原理

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，用镀铜镉粒使部分滤液中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。在滤液和已还原的滤液中，加入磺胺和N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光光度计在538 nm 波长下测其吸光度。将测得的吸光度与亚硝酸钠标准系列溶液的吸光度进行比较，就可计算出样品中的亚硝酸盐含量。

1.2.2 试剂与设备

1）试剂及配制

测定用水应是不含硝酸盐和亚硝酸盐的蒸馏水或去离子水

（1）亚硝酸钠（NaNO2）。

（2）硝酸钾（KNO3）。

（3）镀铜镉柱

镉粒直径0.3mm～0.8mm。也可按下述方法制备。将适量的锌棒放入烧杯中，用40g/L 的硫酸镉（CdSO4·8H2O）溶液浸没锌棒。在24 h 之内，不断将锌棒上的海绵状镉刮下来。取出锌棒，滗出烧杯中多余的溶液，剩下的溶液能浸没镉即可。用蒸馏水冲洗海绵状镉2 次，然后把镉移入小型搅拌器中，同时加入400mL 0.1mol/L 的盐酸。搅拌几秒钟，以得到所需粒度的颗粒。将搅拌器中的镉粒连同溶液一起倒回烧杯中，静置几小时，这期间要搅拌几次以除掉气泡。倾出大部分溶液，立即镀铜。

（4）硫酸铜溶液：溶解20 g 硫酸铜（CuSO4·5H2O）于水中，稀释至1000 mL。

（5）盐酸-氨水缓冲溶液：pH 9.60～9.70。用600mL 水稀释75mL浓盐酸（质量分数为36%～38%）。混匀后，再加入135mL 浓氨水（质量分数等于25 %的新鲜氨水）。用水稀释至1000mL，混匀。用精密pH计调pH 值为9.60～9.70。

（6）盐酸(2mol/L)：160mL 的浓盐酸（质量分数为36%～38%）用水稀释至1000mL。

（7）盐酸（0.1mol/L）：50mL 2mol/L 的盐酸用水稀释至1000mL。

（8）沉淀蛋白和脂肪的溶液：

①硫酸锌溶液：将53.5g 的硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶于水中，并稀释至100 mL。

②亚铁氰化钾溶液：将17.2g 的三水亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水中，稀释至100mL。

（9）EDTA溶液：用水将33.5g的乙二胺四乙酸二钠（Na2C10H14N2O3·2H2O）溶解，稀释至1000 mL。

（10）显色液1：体积比为450:550 的盐酸。将450mL 浓盐酸（质量分数为36 %～38 %）加入到550mL 水中，冷却后装入试剂瓶中。

（11）显色液2：5g/L 的磺胺溶液。在75mL 水中加入5mL 浓盐酸（质量分数为36 %～38 %），然后在水浴上加热，用其溶解0.5g 磺胺（NH2C6H4SO2NH2）。冷却至室温后用水稀释至100mL。必要时进行过滤。

（12）显色液3 ：1 g/L 的萘胺盐酸盐溶液。将0.1 g 的N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐（C10H7NHCH2CH2NH2·2HCl）溶于水，稀释至100 mL。必要时过滤。

（13）亚硝酸钠标准溶液：相当于亚硝酸根的浓度为0.001 g/L。

将亚硝酸钠在115 ℃的范围内干燥至恒重。冷却后称取0.150g，溶于1000 mL 容量瓶中，用水定容。在使用的当天配制该溶液。取10mL 上述溶液和20mL 缓冲溶液于1000mL 容量瓶中，用水定容。每1mL 该标准溶液中含1.00 μg 的NO2

（14）硝酸钾标准溶液相当于硝酸根的浓度为0.0045 g/L。

将硝酸钾在115℃的温度范围内干燥至恒重，冷却后称取1.4580 g，溶于1000mL 容量瓶中，用水定容。在使用当天，于1000mL 的容量瓶中，取5mL 上述溶液和20mL 缓冲溶液，用水定容。每1 mL 的该标准溶液含有4.50μg 的NO3

2）设备

所有玻璃仪器都要用蒸馏水冲洗，以保证不带有硝酸盐和亚硝酸盐。

（1）天平：感量为0.1 mg 和1 mg。

（2）烧杯：100 mL。

（3）锥形瓶：250 mL，500 mL。

（4）容量瓶：100 mL、500 mL 和1000 mL。

（5）移液管：2 mL、5 mL、10 mL 和20 mL。

（6）吸量管：2 mL、5 mL、10 mL 和25 mL。

（7）量筒：根据需要选取。

（8）玻璃漏斗：直径约9 cm，短颈。

（9）定性滤纸：直径约18 cm。

（10）还原反应柱：简称镉柱。

（11）分光光度计：测定波长538 nm，使用1cm～2cm 光程的比色皿。

（12）pH 计：精度为±0.01，使用前用pH7 和pH9 的标准溶液进行校正。

3）分析步骤

（1）制备镀铜镉柱

①置镉粒于锥形瓶中（所用镉粒的量以达到要求的镉柱高度为准）。

②加足量的盐酸以浸没镉粒，摇晃几分钟。

③滗出溶液，在锥形烧瓶中用水反复冲洗，直到把氯化物全部冲洗掉。

④在镉粒上镀铜。向镉粒中加入硫酸铜溶液（每克镉粒约需2.5 mL），振荡1 min。

⑤滗出液体，立即用水冲洗镀铜镉粒，注意镉粒要始终用水浸没。当冲洗水中不再有铜沉淀时即可停止冲洗。

⑥在用于盛装镀铜镉粒的玻璃柱的底部装上几厘米高的玻璃纤维。在玻璃柱中灌入水，排净气泡。

⑦将镀铜镉粒尽快地装入玻璃柱，使其暴露于空气的时间尽量短。镀铜镉粒的高度应在15cm～20cm 的范围内。注1：避免在颗粒之间遗留空气。注2：注意不能让液面低于镀铜镉粒的顶部。

⑧新制备柱的处理。将由750mL 水、225mL 硝酸钾标准溶液、20mL缓冲溶液和20mLEDTA 溶液组成的混合液以不大于6mL/min 的流量通过刚装好镉粒的玻璃柱，接着用50mL 水以同样流速冲洗该柱。

（2）检查柱的还原能力

①用移液管将20mL 的硝酸钾标准溶液移入还原柱顶部的贮液杯中，再立即向该贮液杯中添加5mL 缓冲溶液。用一个100mL 的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不应超过6mL/min。

②在贮液杯将要排空时，用约15mL 水冲洗杯壁。冲洗水流尽后，再用15mL 水重复冲洗。当第二次冲洗水也流尽后，将贮液杯灌满水，并使其以最大流量流过柱子。

③当容量瓶中的洗提液接近100mL 时，从柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混合均匀。

④移取10mL 洗提液于100mL 容量瓶中，加水至60mL 左右。

⑤根据测得的吸光度，从标准曲线上可查得稀释洗提液中的亚硝酸盐含量（μg/mL）。据此可计算出以百分率表示的柱还原能力（NO-的含量为0.067μg/mL 时还原能力为100%）。如果还原能力小于95%，柱子就需要再生。

（3）样品的称取和溶解

①婴幼儿配方米粉样品：在100mL 烧杯中称取10g 样品，准确至0.001g。用112mL 52 ℃的水将样品洗入500 mL 锥形瓶中，混匀。用铝箔纸盖好锥形瓶口，将溶好的样品在沸水中煮15min，然后冷却至约50 ℃。

（4）脂肪和蛋白质的去除

①按顺序加入24mL 硫酸锌溶液、24mL 亚铁氰化钾溶液和40 mL 缓冲溶液，加入时要边加边摇，每加完一种溶液都要充分摇匀。

②静置1 h。然后用滤纸过滤，滤液用250mL 锥形瓶收集。

（5）硝酸盐还原为亚硝酸盐

①移取20mL 滤液于100mL 小烧杯中，加入5mL 缓冲溶液，摇匀，倒入镉柱顶部的贮液杯中，以小于6mL/min 的流速过柱。洗提液（过柱后的液体）接入100mL 容量瓶中。

②当贮液杯快要排空时，用15mL 水冲洗小烧杯，再倒入贮液杯中。冲洗水流完后，再用15mL 水重复一次。当第二次冲洗水快流尽时，将贮液杯装满水，以最大流速过柱。

③当容量瓶中的洗提液接近100mL 时，取出容量瓶，用水定容，混匀。

（6）测定

①分别移取20mL 洗提液和20mL 滤液于100mL 容量瓶中，加水至约60mL。

②在每个容量瓶中先加入6mL 显色液1，边加边混；再加入5mL显色液2。小心混合溶液，使其在室温下静置5min，避免直射阳光。

③加入2mL 显色液3，小心混合，使其在室温下静置5min，避免直射阳光。用水定容至刻度，混匀。

④在15min 内用538nm 波长，以空白试验液体为对照测定上述样品溶液的吸光度。

（7）标准曲线的制作

①分别移取（或用滴定管放 出）0mL、2mL、4mL、6mL、10mL、12 mL、16mL 和20mL 亚硝酸钠标准溶液于9 个100mL 容量瓶中。在每个容量瓶中加水，使其体积约为60 mL。

②在每个容量瓶中先加入6mL 显色液1，边加边混；再加入5mL显色液2。小心混合溶液，使其在室温下静置5min，避免直射阳光。

③加入2mL 显色液3，小心混合，使其在室温下静置5min，避免直射阳光。用水定容至刻度，混匀。

④在15min 内，用538nm 波长，以第一个溶液（不含亚硝酸钠）为对照测定另外八个溶液的吸光度。

⑤将测得的吸光度对亚硝酸根质量浓度作图。亚硝酸根的质量浓度可根据加入的亚硝酸钠标准溶液的量计算出。亚硝酸根的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标。亚硝酸根的质量浓度以μg/100mL 表示。

（8）按公式计算含量。

2 结果与讨论

2.1 两种方法测定结果比较

取5 个不同样品，分别采用分光光度法和乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定法进行检测。结果见表1。

表1

从上表数值可以发现2 种方法检测结果最小相差2.45%，最大的相差2.56%，误差很大，因婴幼儿配方米粉的亚硝酸盐的限量为不超过2mg/kg，从上面的5 个检测数据可以发现：采用分光光度法检测的结果全部超过2mg/kg，产品全部超标，严重影响亚硝酸盐项目的准确性。

2.2 用GB 5009.33—2010 的第一法离子色谱法和第三法乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定法比较见表2。

从表2 数值可以看出，用第一法离子色谱法和第三法乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定法的检测结果是十分接近。

2.3 讨论

用GB 5009.33—2010 中第二法分光光度法检测婴幼儿配方米粉，由于米粉中含有淀粉，并且蛋白质的含量较高（含量都超过7%），造成样品处理后的溶液比较浑浊，用比色法来确定亚硝酸盐的含量存在很大的误差，检验结果不能真实反映产品实际含有亚硝酸盐的含量；虽然在实际工作中会加入淀粉酶进行酶解，使处理后的溶液澄清，但由于没有加入的标准，淀粉酶的加多加少会影响检验结果的准确性，检验结果存在很大误差。用GB 5009.33—2010 中第三法 乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定法来检测，由于该方法是针对乳制品设置的检验方法，特别是针对蛋白质和脂肪含量较高的食品，检验过程采用比较多的沉淀剂，使样品处理后的溶液比较澄清，从而大大的减少比色过程中带来的误差，保证检测结果的正确性。

表2

因此中婴幼儿配方米粉中亚硝酸盐含量的检测方法不能选用GB 5009.33—2010 中第二法分光光度法进行检测。

［1］GB 10769—2010 食品安全国家标准：婴幼儿谷类辅助食品[S].

［2］GB 5413.5-2010 食品安全国家标准：食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S].

［3］广州质量监督检测研究院出具的编号为食许2013-05-0181 检验报告[R].