气相色谱-四极杆飞行时间质谱准确鉴定常见水果蔬菜中的农药残留

李晓颍， 张红医， 常巧英， 范春林＊， 庞国芳， 曹 喆， 王雯雯

（1.河北大学化学与环境科学学院，河北 保定071002；2.中国检验检疫科学研究院，北京100123；3.安捷伦科技有限公司，北京100102）

世界范围内常用的农药有千余种，这给农药的检测带来了一定的难度。目前农残检测过程主要包括样品前处理与检测部分。常用的农药多残留前处理技术主要有基质固相分散萃取［1-4］、固相萃取［5-7］、凝 胶 渗 透 色 谱［8］以 及QuEChERS 法［9-11］等。检测方法以色谱-质谱联用技术为主，常见的有气相色谱-串联质谱法（GC-MS／MS）［2-4，12］、气相色谱-质谱 法（GC-MS）［13，14］、液 相 色 谱-串 联 质 谱 法（LC-MS／MS）［11，15，16］、气 相 色 谱-飞 行 时 间 质 谱 法（GC-TOF MS）［17-22］、液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF MS）［23-25］等。近 年 来 高 分 辨 质 谱（HR-MS）的应用也为残留分析提供了可靠依据。

GC-TOF MS分析方法通常评价3～5个特征离子，要求两个及以上特征离子出峰且离子丰度比在特定范围内（定性点大于4）作为定性依据［26，27］。但该方法仅适合于具有一定数量特征离子且出峰良好的化合物的测定。在实际样品分析过程中，存在目标物含量低、干扰严重等现象，导致目标离子并非完全出现，离子丰度比变化较大。Portolés等［22］就曾指出在低浓度下离子丰度偏差大，很难符合定性限定要求。此外，有些农药的谱图只有1～2个特征离子，按照前述方法定性面临困难。近年随着仪器的发展已将四极杆-飞行时间质谱应用于气相色谱分析当中，通过二级质谱测定与配套数据分析软件的使用可实现化合物的准确鉴定。2010 年，Portolés等［28］使用大气压化学电离源气相色谱-四极杆飞行时间质谱（APGC-QTOF MS）进行农药残留 分 析。2012 年，Canellas 等［29］描 述 了APGCQTOF MS用于包装污染物的鉴定。2012年，Zhang等［30］应用GC-QTOF MS同时建立了187种农药一级与二级精确质量数据库用于蔬菜中农药残留检测，采用离子对（母离子-子离子）方式进行库检索分析。该方法虽实现了二级质谱确证分析，但评价离子个数有限。到目前为止，应用GC-QTOF MS 建立二级谱图库，进行谱图检索与镜像对比确证分析尚未见报道。

本文分别建立了152种常见农药的GC-QTOF MS一级精确质量数据库与相应农药二级谱图库。应用一级数据库对具有足够明显特征离子的农药进行鉴定，对部分疑似农药进行二级确证，该方法可实现常见果蔬中农药残留的准确鉴定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦7200 GC-QTOF MS（安捷伦科技公司，美国）；移液器（Eppendorf公司，德国）；SR-2DS水平振荡器（TAITEC 公司，日本）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；N-EVAP112氮吹仪（OA-SYS公司，美国）；8893 超声波清洗仪（Cole-Pamer公司，美国）；TL-602L 电子天平（Mettler公司，德国）；80 mL塑料离心管若干。

152种农药标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于95%；乙腈、正己烷和甲醇等有机溶剂均为色谱纯（Honeywell公司，美国）；乙酸、NaCl和无水MgSO4均为分析纯（西陇化工股份有限公司）；提取液：含1%（v／v）醋酸乙腈；洗脱液：乙腈-甲苯（3∶1，v／v）；Carbon NH2SPE 柱（Waters公司）。果蔬样品均购自各大超市。

农药单标准溶液的配制：准确称取10 mg（精确至0.01 mg）各种农药标准品分别置于10 mL容量瓶中，根据标准物的溶解性和测定的需要分别用甲醇、甲苯和丙酮等溶剂溶解并定容至刻度，于4℃下避光保存。

农药混合标准溶液的配制：为了实现药物的更好分离，根据每种农药的化学性质和保留时间把农药分成A、B 两组，每组混合标准农药为70 余种。根据单标准溶液的浓度，准确移取一定体积的每种单标准溶液至25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使混合标准溶液中每种农药的质量浓度均为10 mg／L，于4 ℃下避光保存。

1.2 色谱条件

气相色谱柱为VF-1701 ms质谱专用柱（30 m×0.25 mm×0.25μm；安捷伦公司，美国）。程序升温过程：40 ℃下保持1 min，然后以30 ℃／min升温至130 ℃，再以5 ℃／min升温至250 ℃，再以10℃／min升温至300 ℃，保持5 min；载气：氦气，纯度≥99.999%，流速1.2 mL／min；进样口温度：290℃；进样量：1μL；进样方式：不分流进样；环氧七氯用于校正保留时间。

1.3 质谱条件

电子轰击电离源（EI源）电压：70 eV；离子源温度：230 ℃；GC-MS接口温度：280 ℃；溶剂延迟：6 min。一级质谱质量扫描范围：m／z 50～600；采集速率：2 spectra／s；二级质谱质量扫描范围：m／z 50～400；采集速率：200 ms／spectrum；对m／z 264的分辨 率 为14 000（半 高 峰 宽（FWHM））；安 捷 伦MassHunter工作软件。

1.4 样品前处理

取足量的果蔬样品粉碎，混匀。称取10.0 g上述样品于80 mL具塞离心管中，加入40 mL含1%醋酸的乙腈提取液，高速匀浆机均质1 min，加入1 g NaCl、4 g无水硫酸镁，振荡提取10 min，于4 200 r／min下离心5 min；取20 mL上清液至150 mL鸡心瓶中，旋转蒸发仪中浓缩至2 mL 左右。在Carbon NH2柱中加入2 cm 高无水硫酸钠、4 mL洗脱液活化。将浓缩液移至SPE 柱，下接80 mL 鸡心瓶，流出液自然滴入鸡心瓶中；将150 mL鸡心瓶用2 mL洗脱液润洗3次，均转移至SPE 柱中，最后将SPE柱用25 mL洗脱液洗脱，流出液全部收集至鸡心瓶中。将流出液在旋转蒸发仪中浓缩至1～2 mL，氮吹至近干，用1 mL 正己烷定容，过0.2μm滤膜至进样小瓶，滤液供GC-QTOF MS分析。

2 结果与讨论

按照1.4节的前处理方法提取、净化样品，进行一级全扫描（scan）测定；对测定结果进行一级数据库检索，实现部分农药的确证（以3个及以上特征离子符合条件且丰度比合适为鉴定依据），并发现疑似农药（即特征离子出峰情况不足以定性农药）；之后对含有疑似农药的样品在二级最佳碰撞诱导解离（CID）能量下进行测定；经二级谱图库检索实现疑似农药的确证。农药的检测与确证过程见图1。

2.1 一级精确质量数据库特征离子信息

图1 农药检测与确证流程图Fig.1 Flowsheet of pesticide detection and identification

一级质谱.csv格式数据库包含每种农药的保留时间、特征离子分子式、精确Mr。特征离子分子式的计算需对农药标准品进行测定，并在软件中给定农药元素组成信息，软件生成分子式后结合农药结构进行验证，并以此计算理论Mr。每种农药包含3～5个特征离子，部分特征离子信息见表1。

表1 152种农药部分特征离子信息Table 1 Part information of the characteristic ions of 152 pesticides

表1 （续）Table 1 （Continued）

表1 （续）Table 1 （Continued）

表1 （续）Table 1 （Continued）

2.2 二级质谱图库的建立

2.2.1 母离子选择原则

对所有农药采集了最佳CID 下的二级质谱图，每种农药选择1个特征离子作为母离子进行二级质谱采集，原则如下：（1）选择丰度最高的离子作为母离子；（2）当丰度最高的离子的Mr较低时，为了获得准确、丰富的碎片信息，应选择次高丰度但Mr较大的特征离子作为母离子。

2.2.2 优化二级质谱最佳的CID 能量

分别对每种农药采集了5、10、15、20、25 和30 eV CID 能量下的二级质谱图，根据不同碰撞能下母离子的碎裂程度，选择二级质谱图中特征离子明显、分布均匀、响应良好的二级质谱图作为最佳CID 质谱图。图2为o，p′-DDD 最佳CID 谱图的选择过程。由此可见，碰撞能的高低影响二级质谱特征离子的丰度。碰撞能过高（20 eV 以上）时，离子碎裂程度较大，特征离子的丰度普遍较低，不适宜作为最佳的碰撞能量；碰撞能量过低（5 eV）时，母离子碎裂程度差，丰度高，子离子丰度均较低，特征性差，同样不宜作为最佳碰撞能。当CID 能量为10 eV 时，各特征离子均有较高的丰度，故选择10 eV 为最佳CID 能量。本实验按此方法优化了每种农药的最佳CID 能量，并建立了二级质谱特征离子.xml谱图库。

2.3 二级质谱采集速率对测定结果的影响

采集速率影响信号强度与峰形［21］。本文考察了不同采集速率对二级质谱测定结果的影响。在果蔬基质中分别添加15 种常见农药至1、2、5、10 μg／kg 4 个水平，在不同采集 速率（150、200、300、400、500 ms／spectrum）下测定，结果显示当采集速率为200 ms／spectrum 时农药二级质谱的检出情况最佳（见图3），与数据库匹配程度良好，因此实验选择采集速率200 ms／spectrum 为二级质谱的采集速率。

2.4 TOF MS数据分析

TOF MS的优势在于其精确质量全扫描能力与窄质量窗口提取［31］。采用窄质量窗口有效降低了背景干扰，提高了信噪比。质量偏差（ppm）是化合物准确定性的一项重要依据，质量偏差大小影响离子出峰的真实性。通过建立一级精确质量数据库，在定性软件Find compound by formula下进行特征离子提取，设定提取窗口为20 ppm，软件将依据数据库中的保留时间、特征离子分子式、理论相对分子质量及同位素分布情况对实测离子进行评价，通过该方法可实现部分农药的一级确证及发现疑似农药。图4是甘蓝中添加敌敌畏5μg／kg时特征离子的检出情况。由图4可知，所选择的敌敌畏4个特征离子均有检出，质量偏差均小于5 ppm，丰度比合适。这种情况可以作为定性依据，符合欧盟的相关要求。

图2 o，p′-DDD 二级质谱特征离子丰度随CID 能量变化情况Fig.2 Relationships of characteristic ion intensities and CID energies of o，p′-DDD in MS2

图3 不同二级质谱采集速率下15种农药的检出情况Fig.3 Detection of 15 pesticides at different MS2acquisition rates

图4 添加敌敌畏5μg／kg的甘蓝样品的提取离子流图（20 ppm）Fig.4 Extracted ion chromatograms（20 ppm）of dichlorvos spiked in cabbage at 5μg／kg

对于特征离子较少的农药，仅通过一级质谱数据很难做出准确的判断，如图5 所示，以cis-permethrin为例，添加水平分别为2μg／kg和5μg／kg时，特征离子m／z 183出峰明显，但其他两个离子的出峰情况均较差，低添加水平（如2μg／kg）时，这种现象更加明显，其余两个离子几近未出峰，难以判断。这种情况下需进行二级质谱特征谱图分析，做进一步判断；同样农药perthane则只能看到m／z 223明显出峰，其他离子响应极低，单凭一个特征离子难以准确定性。

图5 添加不同水平的cis-permethrin与perthane的甘蓝样品的提取离子流图Fig.5 Extracted ion chromatograms of cis-permethrin and perthane spiked in cabbage at different concentrations

通过上述方法对一级质谱数据进行分析，可以对部分农药进行准确定性，并发现疑似农药；对于疑似农药还需进行二级确证。

2.5 二级质谱结果分析

二级质谱测定主要针对一级质谱未能完全定性的农药，包括本身缺少特征离子的农药；亦包括在某些基质干扰情况下，部分特征离子未能检出，不满足定性要求的情况。仍以cis-permethrin为例，母离子m／z 183在添加水平为2μg／kg、CID 为20 eV 时二级谱图库检索后的镜像结果（见图6）表明，库匹配良好。显然，在一级质谱不足以定性的情况下，有必要进行二级质谱确证。

二级处理过程需根据疑似农药编辑数据采集方法并对样品重新测定，在定量软件中应用Find compound by target MS／MS 提取二级质谱结果，再经Search unit mass library进行谱库检索，并给出镜像对比结果，进而实现疑似农药的进一步确证。该方法提高了农药的鉴定准确度，弥补了一级TOF MS鉴定的不足之处。

图6 甘蓝样品中添加2μg／kg cis-permethrin的二级质谱镜像结果Fig.6 MS2 spectral difference result of cis-permethrin spiked in cabbage at 2μg／kg

2.6 方法学验证

2.6.1 回收率

本文根据农药的一级质谱特征离子建立了一级质谱定量处理软件，将最高丰度的离子作为定量离子，其他次高丰度的离子作为定性离子。在甘蓝、番茄、梨3种样品中分别添加5.0和10.0μg／kg标准品并测定回收率。并按照欧盟SANCO／825／00［32］要求，对回收率进行评价。统计结果显示，在上述两种添加水平下回收率在70%～120%之间的农药比例在甘蓝基质中分别为91.45%、94.08%，在番茄基质中分别为88.20%、88.80%，在梨基质中分别为86.84%、92.10%，测定结果符合相关要求。

2.6.2 检出限和定量限

在甘蓝、番茄、梨3 种空白基质中分别添加1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg／kg系列水平的目标物标准品，按建立的方法进行样品前处理及测定，建立基质标准曲线，结果显示3种基质中线性相关系数r2﹥0.990 的 农 药 比 例 分 别 为94.7%、96.7%、93.4%。以S／N ＝3 和S／N ＝10 分别计算方法的LOD 和LOQ，其范围分别为甘蓝0.01～9.19μg／kg 和0.05～30.65μg／kg，番 茄0.01～9.19μg／kg和0.03～30.62μg／kg，梨0.02～42.8 μg／kg和0.06～141.6μg／kg（152种农药的线性相关系数、LOD、LOQ 数据略）。线性范围为1～2个数量级，适合1～50μg／kg含量水平分析。

2.7 实际样品分析

本实验在4个不同地点采集了苹果、芹菜、梨、桃子、甘蓝、番茄6种果蔬共24个样品，按照建立的方法进行前处理及检测，通过基质标准曲线定量，检测结果见表2，部分农药进行了二级质谱确证，镜像结果见图7。从实际样品检测结果看，毒死蜱的检出率较高，占68.8%，由此可见在农药使用过程中，毒死蜱的使用率较高；农药残留水平大多处于10 μg／kg以下，超标情况较少。但在第3批芹菜中五氯硝基苯（quintozene）与戊唑醇（tebuconazole）的检出含量较高，严重超欧盟限量20倍与50倍，这两种农药均为目前使用较广的低毒农药，但其高含量仍令人担忧。其次检出了部分国家全面禁止使用的药物，如芹菜中检出beta-HCH 等。

表2 实际样品中检出的农药种类及其含量Table 2 Kinds and contents of pesticides found in real samples

图7 芹菜样品中检出quintozene的二级质谱镜像对比Fig.7 MS2 spectral difference result of quintozene found in a celery sample

3 结论

基于GC-QTOF MS分别建立了152种常见农药的一级精确质量数据库与二级谱图库。实验基于SPE法，以1%醋酸乙腈与Carbon NH2柱对样品进行提取与净化，实现了对152种常见农药的准确鉴定。通过应用QTOF二级谱图检索，实现了对某些一级质谱特征离子数较少的农药与基质干扰下出峰情况不佳农药的进一步确证，提高了鉴定的可靠性，同时扩大了农药的分析范围。该方法是复杂基质中农药准确鉴定的可靠途径。

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