盐酸吡哆辛在聚烟酸修饰电极上的电化学行为及测定*

顾小燕，唐鹏鹏，李宁波，刘欢，俞静，何凤云

(南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，南京 211171)

盐酸吡哆辛(Pyridoxine hydrochloride，VB6)是一种动植物体内广泛存在的辅酶类B族维生素。VB6在氨基酸的合成和分解过程有着重要作用，在人体内代谢成磷酸吡哆醛并参与多种代谢反应，人体过少或过多摄入VB6都会对人体造成不良影响，因此建立一种简便、快速、准确的VB6含量测定方法具有重要意义。

目前对VB6的检测方法有高效液相色谱法［1］，荧光法［2］、紫外分光光度法［3］、氯酸非水滴定法［4］、毛细管电泳法［5］等。与这些传统方法相比，电化学法具有操作简便快速、灵敏度高等优点而被广泛应用于现场快速测定，而VB6具有电化学活性，可用电化学方法直接测定［6］。目前测定VB6的电化学方法中，多采用化学修饰电极，修饰材料包括三联吡啶钌修饰硼掺杂氧化金刚石电极［7］、电化学物质掺杂的聚(3，4)-乙烯二氧噻吩膜修饰电极［8］、聚苯胺蓝／多壁碳纳米管［9］、聚氨基黑10B［10］、聚L-色氨酸修饰［11］、聚硫堇／亚铁氰根修饰碳糊电极［12］和纳米金／石墨烯电极［13］等。

烟酸(3-吡啶甲酸)具有重要的生理作用，目前已有研究其电化学行为的报道［14–15］，但是利用其作为电极修饰材料则鲜有报道［16–17］。笔者用烟酸作为聚合材料，制备的聚烟酸膜修饰电极对VB6的检测具有良好的增敏作用，并可显著提高电极的稳定性。实验探讨了支持电解质种类、支持电解质溶液pH、扫描速度等参数对测定盐酸吡哆辛的影响，优化了测试条件，建立了快速测定盐酸吡哆辛的电化学方法，结果满意。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电化学工作站：CHI660C型，上海辰华仪器公司；

精密pH计：pH–3C型，上海雷磁仪器厂；

超声波清洗器：KQ2200型，昆山市超声仪器有限公司；

维生素B6片：南京白敬宇制药有限责任公司；

烟酸：化学纯，上海化学试剂公司；

盐酸吡哆辛：生化试剂，中国慧兴生化试剂有限公司；

实验用其它试剂均为分析纯；

实验用水为二次去离子水。

1.2 修饰电极的制备

将玻碳电极在金相砂纸上打磨，用0.05 μm的氧化铝粉末抛光成镜面后，去离子水冲洗后依次放入硝酸(体积比为1∶1)、乙醇、水中超声1 min，自然风干后待用。将活化后的玻碳电极(GCE)置于含有0.02 mol／L烟酸(NA)的pH 7.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，在–1.8～2.4 V范围内以0.1 V／s扫描速度电聚合10圈，取出后用水淋洗，自然风干即制得聚烟酸修饰玻碳电极(PNA／GCE)。

1.3 实验方法

取适量的盐酸吡哆辛标准溶液或者样品待测液置于电解池中，采用三电极体系进行测量，以GCE或者PNA／GCE为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极(本实验所述电位均是相对此电极而言)，铂片电极为对电极，进行循环伏安法(CV)或差分脉冲伏安法(DPV)扫描。

把制备好的修饰电极放在pH 3.6的HAc–NaAc缓冲溶液中静置2 s后，以100 mV／s的扫描速度扫描200圈，可以充分减小充电电流。每次在测试结束后将电极放入空白底液中多次扫描直至无明显氧化峰出现，即可将吸附在电极表面的残余VB6除去，恢复电极活性。所有实验均在室温(25±1)℃下进行。

2 结果与讨论

2.1 PNA／GCE的电化学行为

聚烟酸(PNA)在GCE上的循环伏安图如图1所示。当扫描第一圈时，分别在–0.3，0.4，1.5 V处出现一个还原峰和两个氧化峰，随着扫描圈数的增加，峰电流随之增加，说明聚烟酸膜的厚度在不断增加。当扫描圈数达到10圈时，峰电流趋于稳定，同时肉眼可观察到电极表面有一层有光泽的蓝绿色膜生成，说明此时聚烟酸修饰膜已经通过电聚合方法生成。

实验还发现，新制备的修饰电极在空白底液中反复扫描可大大减小充电电流、改善峰形，这可能是在酸性条件下聚合物分子在GCE在基底上存在重新排列或重新聚合的过程，从而使聚合膜更有利于VB6的电子转移。

图1 烟酸聚合过程循环伏安曲线

2.2 VB6在PNA／GCE上的电化学响应

如图2所示，VB6在裸电极与聚烟酸修饰电极上均只出现了氧化峰而无对应的还原峰，说明VB6在电极上为完全不可逆氧化过程。在裸玻碳电极上(曲线a)出现一个宽而弱的氧化峰(Ipa=6.33 μA)，在PNA／GCE(曲线b)上峰形变好，峰电流增大为原来的2.70倍(Ipa=17.82 μA)，说明烟酸对VB6的测定具有明显的增敏作用。

图2 0.2 mmol／L盐酸吡哆辛在不同电极上的循环伏安图

2.3 测试条件的优化

2.3.1 聚合圈数的影响

在浓度为0.2 mmol／L的VB6溶液中，以不同圈数对聚烟酸电极进行循环伏安测定，实验发现聚合烟酸时随着扫描圈数的增加，电极聚合烟酸测定的VB6特征峰逐渐变大，当扫描圈数达到10圈时，峰电流最大且基本稳定，聚合烟酸膜基本稳定。当扫描圈数大于10圈时峰电流开始减小，可能是因为修饰膜厚度过大电阻增大，因此聚合烟酸的扫描圈数设定为10圈。

2.3.2 扫描速度的影响

考察了扫描速度对VB6氧化峰电流和电位的影响，见图3。由图3可以看出，随着扫描速度的增大，峰电位逐渐正移，峰电流增大，但随着扫描速度增大，噪声变大，综合各方面的因素，选择100 mV／s扫描速度进行以下试验。数据经拟合后(见图4)发现，VB6氧化峰电流Ipa(μA)与扫描速度的平方根v1／2(mV／s)呈 良 好 的 线 性 关 系，线 性 方 程 为Ipa=1.84v1／2–1.91(r2=0.991 5)，这说明VB6在电极上的氧化过程受扩散控制。VB6氧化峰电位Epa(V)与lnv(mV／s)呈线性关系(见图5)，线性方程为Epa=0.025 3lnv+0.992 6(r2=0.992 5)，该方程可用于计算氧化过程中的电子转移数。

图3 在不同扫描速度下VB6在PNA／GCE上的循环伏安图

图4 VB6的氧化峰电流与扫描速度的平方根的关系

图5 VB6的氧化峰电位与lnv的关系

2.3.3 缓冲溶液pH对VB6的影响

以聚烟酸修饰电极为工作电极在100 mV／s的扫描速度下考察不同pH对VB6的峰电位与峰电流的影响。图6为VB6在pH为2.9，3.0，3.1，3.4，3.6，4.0，4.4的不同缓冲溶液中的CV图。从图6可以看出，当缓冲溶液pH值为3.6时，VB6氧化峰的电流值达到最大，所以选择pH 3.6的缓冲溶液作为支持电解质。随着pH值的增大，氧化峰电位逐渐负移，说明电极反应过程有质子参与。经拟合后，VB6氧化峰电位和pH呈良好的线性关系，线性方程为Epa(V)=–0.113 7pH+1.496 8 (r2=0.998 0)，可知VB6在PNA／GCE上反应过程中涉及的质子数电子数之比是2。

图6 VB6在不同pH的缓冲溶液中的循环伏安图

2.4 VB6在PNA／GCE上的氧化过程

对于不可逆的电极反应过程，峰电位根据Bulter–Volmer公式［11］(1)计算：

式中：Ep——峰电位，V；

Eθ——标准电位，V；

α——电子转移系数(对于不可逆反应，α常在0.4～0.6之间取值)；

n——电子转移数；

F——法拉第常数，96 487 C／mol；

R——气体常数，J／(K·mol)；

T——温度，K；

kθ——标准速率常数；

v——扫描速度，mV／s。

由图5拟合峰电位(V)与扫描速度(mV／s)的数据，可以得到方程(r2=0.992 5)见式(2)：

由式(1)可得αn=0.51，此时α取0.5，则计算求得n=1.0，即转移电子数n=1，再根据2.3讨论得到的结论：VB6在PNA／GCE上反应过程中涉及的质子数与电子数之比为2，则VB6在该复合修饰膜上的电极反应是两质子一电子参与的电极过程。

文献［6］报道盐酸吡哆辛在电极上有着复杂的变化过程，第一次扫描时在Epa=0.81 V有一个明显的氧化峰。在酸性条件下，该处的氧化峰对应吡哆醇结构转化成吡哆醛结构，与本实验所观察到的氧化峰基本一致。

2.5 线性方程、线性范围与检出限

为进一步提高检测的灵敏度，采用差分脉冲伏安法测定VB6的含量，在pH 3.60的缓冲溶液中，电位增量0.01 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.2 s，脉冲周期0.5 s，静置时间2 s条件下，不同浓度VB6在PNA／GCE上的差分脉冲伏安图见图7。在0.08～40 μmol／L和40～400 μmol／L范围内，VB6的氧化峰电流Ipa(μA)与浓度c(μmol／L)呈良好的线性关系，线性方程分别为：Ipa=0.167 2c+0.219 6 (r2=0.995 3)和Ipa=0.012 5c+6.501 2(r2=0.993 2)，方法检出限(S／N=3)为0.02 μmol／L。与已报道的测定VB6的电化学方法［6–12］相比，本法检出限更低，与纳米金／石墨烯修饰电极［13］检出限相同，但是本法线性范围宽，制备方便，能满足对样品的实际测定。

图7 不同浓度VB6在PNA／GCE上的差分脉冲伏安图

2.6 重现性与稳定性

在最优条件下，采用循环伏安法用同一根修饰电极对0.2 mmol／L的VB6标准溶液平行测定8次，结果见表1。由表1可知，测定结果的相对标准偏差为3.1%，说明该方法具有良好的精密度。用相同的修饰方法修饰5支电极，测定同一份0.2 mmol／L的标准溶液，结果见表2。由表2可知，相对标准偏差为7.6%，说明该电极具有良好的重现性。将修饰电极避光浸入空白底液放入4℃的冰箱内保存5 d后再次进行测定，电流衰减约15%，由此可见本法修饰电极具有良好的稳定性，克服了化学修饰电极重现性差、不能重复使用的缺点。

表1 同一根修饰电极对0.2 mmol/L的VB6标准溶液平行测定结果

表2 5根电极测定同一份0.2 mmol/L的VB6标准溶液测定结果

2.7 干扰试验

在优化条件下，用聚烟酸修饰电极测对浓度为0.2 mmol／L的盐酸吡哆辛进行干扰测试。试验结果表明，误差在±5%之内时，200倍的K+，Na+，Cl-，NO3–；50倍的SO42–，Ag+，Al3+，Ca2+均不产生干扰；25倍的抗坏血酸和10倍的酪氨酸对实验有干扰。

2.8 样品测定及回收试验

取市售维生素B6片少量，研磨成粉末后用二次水溶解，充分振荡，取上层清液，按照说明书所述，每片含10 mg VB6，稀释到所需浓度，用本方法进行测定，结果见表3。由表3可知，回收率为95.8%～103.7%，说明该方法具有较高的准确度，可用于实际样品的测定。

表3 维生素B6片中VB6含量的测定结果

3 结论

研究了VB6在聚烟酸修饰电极上的电化学行为，该修饰电极能够明显提高VB6的氧化电流，检出限低至0.02 μmol／L，且该电极稳定性好，制备简单，实用性好，可实现药物中VB6的快速灵敏检测，为VB6的质量控制提供了一种新的方法。

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