PCV2 与PPV 体外混合感染猪肺泡巨噬细胞对细胞因子的影响

王永帅，唐 波， 张雪花， 华 涛， 常 晨， 刘国洋， 侯继波， 张道华，

杨德吉1

(1.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京210095;2.江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014)

猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒，是猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的必须病原，是危害当今全球养猪业最主要的免疫抑制性疾病之一［1-3］。断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是PCVAD 的一种重要的表现形式，严重影响仔猪断奶后的生长发育［4］。无论在临床或实验条件下，单独的PCV2 感染很难诱发PMWS，在临床条件下PCV2 与猪细小病毒(PPV)混合感染可以显著提高PMWS 发病率［5-7］，另外在试验条件下PPV 已被广泛应用于PMWS 的发病模型［6，8-9］。PCV2 与PPV 共同的靶细胞猪肺泡巨噬细胞(PAMs)［10-13］是猪体先天性免疫的第一道防线［14］，当PAMs 感染PCV2 或与PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)混合感染后可以增强IL-10 或TNF-α 等免疫调节性细胞因子的作用，导致免疫抑制或对猪体先天性免疫产生损伤［15］。PPV 同样可感染PAMs，而关于PCV2 与PPV 共同感染PAMs 并对其细胞因子影响的研究较少。本研究通过PCV2 和PPV 混合感染体外猪肺泡巨噬细胞，测定两种病毒在该细胞中的增殖规律及不同细胞因子mRNA 表达水平，以阐明PMWS 发病机理，为有效预防和治疗该病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病毒

PCV2 病毒NJ 株由本实验室分离并保存，其TCID50为1 ml 105.6。PPV 病毒NJ 株由本实验室分离并保存，其TCID50为1 ml 107。

1.2 试验动物

7 周龄断奶仔猪，经PCR 或RT-PCR 检测PRRSV、PCV2、PPV、PRV(猪伪狂犬病毒)、SIV(猪流感病毒)、CSFV(猪瘟病毒)和猪肺炎支原体均为阴性。用ELISA 检测PPV、PCV2 特异性抗体均为阴性。

1.3 主要试剂和仪器

RNAiso Plus、 PrimeScriptTMReverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司;RPMI 1640 购自Invitrogen 公司;胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。LightCycler480 Realtime PCR 购自罗氏公司，超净台购自苏州净化设备有限公司。AIRTECH超净工作台购自苏州净化设备有限公司，Lightcycler480 实时荧光定量PCR 仪和实时荧光定量PCR加样板购自Roche 公司，Eppendor 微量移液器，倒置荧光显微镜(Zeiss4.7)购自德国zeiss 公司，CO2恒温培养箱购自美国Thermo 公司。

1.4 PAM 的分离

选取2 头7 周龄断奶仔猪，无菌摘取其肺脏，用含有5%FBS 的PBS 100 ml 灌洗肺脏，2 ～5 min 后回收灌洗液，共灌洗3 次。灌洗液经3 层纱布过滤后，1 500 r/min离心10 min，用无菌PBS 洗涤2 次，最后重悬于10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，经0.2%台盼蓝检测细胞活性在95%以上，调整细胞浓度至1 ml 2 ×106个，铺至6 孔细胞板，37 ℃贴壁培养2 h 后弃去未贴壁的细胞，用无菌PBS 清洗细胞表面，37 ℃培养24 h 以备接种病毒。

1.5 试验设计

将生长在6 孔板上的PAMs 细胞分为4 组，分别为PPV 组、PCV2 组、PPV/PCV2 混合感染组和对照组，每组3 个重复。各组按照0.1 MOI 接种病毒，对照组接种等体积的细胞培养液，分别于感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收集细胞，冻存于-80 ℃，之后对各组细胞因子mRNA 水平进行Realtime-PCR 检测，比较组间差异。

1.6 PCV2、PPV 及细胞因子基因实时荧光定量PCR 检测方法的建立

按照常规方法构建PCV2、PPV 和细胞因子基因的重组质粒，并提取阳性重组质粒测定OD260吸光值，参照文献［16］介绍的方法计算出各重组质粒的拷贝数。Realtime-PCR 反应体系:SYBR PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μl，10 μmol/L上、下游引物(表1)各0.5 μl，cDNA 2 μl，加超纯水补足20 μl。按以下程序进行Realtime-PCR 反应:94 ℃预变性5 min;94 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 个循环。

1.7 Realtime-PCR 检测病毒拷贝数及细胞因子mRNA 水平

按照RNAiso 试剂盒说明书提取总RNA，应用PrimeScriptTM反转录酶，以Oligo(dT)15为引物进行反转录获得cDNA 用于检测细胞因子。Realtime-PCR反应体系:SYBR PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μl，10 μmol/L上、下游引物(表1)各0.5 μl，cDNA 2 μl，加超纯水补足20 μl。按以下程序进行Realtime-PCR 反应:94 ℃预变性5 min;94 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 个循环。PCR 反应结束后得到检测样品中细胞因子cDNA 拷贝数。每个细胞因子的检测样品重复3 次。

1.8 数据处理与统计分析

经Realtime-PCR 反应后，获得每个检测样品中细胞因子及管家基因拷贝数，应用2-△△Ct法对各组细胞因子进行比较，数据用SPSS 进行统计学分析，并进行差异分析。

表1 实时荧光定量PCR 引物Table 1 The primers for realtime PCR

2 结果与分析

2.1 PCV2、PPV 及细胞因子基因标准曲线的建立

将含有目的基因片段的重组质粒进行10 倍倍比稀释6 ～7 个梯度(1 μl 109～103)，采用Realtime-PCR 扩增，获得PCV2、PPV 和细胞因子基因的Realtime-PCR 标准曲线和直线回归方程(图1)。结果显示，所有标准曲线的线性回归方程相关系数R2＞0.99，重复性好，可用于计算待测样品的拷贝数。

2.2 PCV2 和PPV 在PAMs 中病毒拷贝数的变化

感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收集感染细胞，应用Realtime PCR 测定各组PAMs 中PCV2和PPV 核酸拷贝数(图2)，结果显示，PCV2 单独感染组与PCV2/PPV 混合感染组相比，在整个试验过程中混合感染组PCV2 核酸拷贝数都高于单独感染组。PPV 单独感染组PPV 核酸拷贝数在24 h 比12 h 提高40%，并持续到试验结束，PPV 单独感染组与PCV2/PPV 混合感染组相比，混合感染组PPV 核酸拷贝数在48 h 后上升，并在60 h、72 h 比PPV 单独感染组高10 倍。

2.3 PCV2 和PPV 体外感染PAMs 对IFN-γ 的影响

PCV2 与PPV 体外感染PAMs 后，收取感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后的PAMs 提取的RNA进行反转录，之后进行Realtime-PCR 检测，检测结果如图3。PCV2/PPV 混合感染组IFN-γ 的表达量显著低于PCV2 或PPV 单独感染组，并低于对照组水平。相比于对照组，PCV2 或PPV 单独感染后能显著促进IFN-γ 表达量的增加，PCV2 促进作用最大。由此说明，PCV2 和PPV 单独感染能激活IFN-γ 的表达，PCV2 和PPV 混合感染可能显著抑制IFN-γ 的表达。

图1 PPV、PCV2 和细胞因子部分基因Realtime-PCR 标准曲线和直线回归方程Fig.1 Standard curve and linear regression of realtime-PCR for PPV，PCV2 and cytokines

图2 PPV 和PCV2 单独以及PPV、PCV2 混合感染病毒拷贝数Fig.2 The copy numbers of PPV，PCV2，and PPV/PCV2 coinfection

图3 PAMs 受PCV2 和PPV 体外感染后IFN-γ 表达量Fig.3 The expressions of IFN-γ mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

2.4 PCV2 和PPV 体外感染PAMs 对TNF-α 的影响

Realtime-PCR 法测定各组PAMs 感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后TNF-αmRNA 表达水平变化。图4 显示，PPV 和PCV2 单独感染都可以引起TNF-α 的大量表达，分别在48 h 和36 h 达到最高峰，之后下降;PCV2/PPV 混合感染导致TNF-α 的持续表达并在48h 达到最高峰，之后下降，在整个试验过程显著高于PCV2 单独感染组和PPV 单独感染组。由此说明，PCV2/PPV 混合感染促进了TNF-α的大量表达。

图4 PAMs 受PCV2 和PPV 体外感染后TNF-α mRNA 定量检测结果Fig.4 The expressions of TNF-α mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

2.5 PCV2 和PPV 体外感染PAMs 对IL-10 的影响

Realtime-PCR 测定各组PAMs 感染12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 后IL-10 的mRNA 表达量变化。图5 显示，PPV 组与PCV2 组IL-10 表达量差异不显著，PCV2/PPV 混合感染组IL-10 表达量在36h和48h 显著高于PCV2 组和PPV 组，其他时间差异不显著。

图5 PAMs 受PCV2 和PPV 体外感染后IL-10 mRNA 定量检测结果Fig.5 The expressions of IL-10 mRNA in PAMs in response to PCV2 and/or PPV infection over time

3 讨论

PMWS 是由猪圆环病毒2 型(PCV2)造成的一种消耗性疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失［6］。PPV 已被用于与PCV2 合并感染引起PMWS的模型［6，8-9，17-19］，有将近15%患有PMWS 的猪存在PCV2 与PPV 的混合感染［20］。单核细胞和巨噬细胞在感染宿主的免疫反应中占据着举足轻重位置。肺泡巨噬细胞(PAMs)能够抵抗各种病原体的感染，是肺脏初级防御中的重要细胞，同时它又是PCV2与PPV 共同的靶细胞［10-13］。本试验将PCV2 与PPV体外单独、混合感染PAMs 后动态检测各细胞因子的变化，推测两种病毒混合感染对机体免疫系统的影响。

本研究通过PCV2 与PPV 体外混合感染PAMs，动态检测PCV2 与PPV 病毒核酸含量。在感染早期，PPV 组中PPV 病毒量略高于PCV2/PPV 混合感染组，但是在感染后期，后者PPV 病毒量明显高于前者，由此推测，在混合感染中，PPV 能促进PCV2感染PAMs，同时PCV2 能显著促进PPV 在PAMs 中的增殖。

国内外研究结果表明，PCV2 与PPV 混合感染可以引起猪体质量下降、黄疸、衰竭、贫血、以及全身淋巴结炎症、肾炎、肺炎等PMWS 的典型症状［17，21］。PCV2 感染可使猪淋巴结、扁桃体、胸腺等局部免疫器官和免疫细胞内细胞因子分泌失衡，导致机体免疫调节功能紊乱和免疫应答能力降低［2，14］。IFN-γ主要由抗原刺激T 细胞产生，在机体抵抗病毒反应和免疫调节中起着重要的作用。刘祥义［14］等PAMs体内试验研究结果表明PCV2/PPV 混合感染使PAMs 持续低水平的IFN-γ 表达。本试验中，PCV2/PPV 混合感染组，IFN-γ 表达量明显减少，IFN-γ 主要发挥免疫调节功能，具有抗病毒能力，由此推测，IFN-γ 表达量的减少增加了病毒感染机率。PCV2/PPV 混合感染组PAMs 持续较低水平的表达IFN-γ可能会导致IL-10 的过量表达，从而导致机体免疫反应失衡，造成更为严重的病理损伤。

TNF-α 是一种前炎性细胞因子，主要由活化的单核-巨噬细胞产生，能起到抵抗细菌或寄生虫感染，阻碍病毒复制，调控细胞生长及调节免疫的作用;是体内热源分子之一，它与炎症感染后体温升高有关。Kim［6］等证明PPV 对猪圆环病毒引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征的增强作用与TNF-α 过量表达有关。Chang 等［22］的研究结果表明PCV2 感染的PAMs 中TNF-α 过量表达。本试验中，PCV2 单独感染TNF-α 表达量明显增加，而且PCV2/PPV 混合感染TNF-α 表达量较PCV2 单独感染组显著增加，由此推断，PPV 的感染活化了PAMs，增强了TNF-α的表达，最终导致体温升高等一系列临床表现。

Darwich 等［23］的研究结果表明亚临床PCV2 感染的猪有短暂的IL-10 过量表达。IL-10 和其他促炎症细胞因子可能在PCV2 致病机制中发挥着重要的作用［24-25］。IL-10 由巨噬细胞、B 细胞、TH2 细胞分泌，能抑制巨噬细胞、抑制TH1 细胞分泌细胞因子，促进B 细胞增殖和抗体生成，促进胸腺和肥大细胞的增殖。本试验中PCV2/PPV 组短暂的IL-10表达量增加，且IFN-γ 的表达持续被抑制，由此推断PPV 与PCV2 混合感染引起IL-10 的过量表达，使肺泡巨噬细胞IFN-γ 表达水平持续较低，导致机体免疫反应失衡，不能有效的清除PCV2 病毒，进而导致更为严重的病理损伤。

综合上述分析结果推测，PPV 与PCV2 混合感染抑制了肺泡巨噬细胞IFN-γ 的表达，并促进了TNF-α 的表达及短暂的IL-10 的表达，导致感染早期机体抗病毒能力降低，引起机体免疫抑制，进而引起感染免疫系统紊乱，影响特异性免疫动能的正常运转，为PMWS 的发病创造了前提条件。

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