柱前衍生-高效液相色谱法检测安立生坦的手性拆分剂L-脯氨酸甲酯

刁兴利，乔红梅，陈磊

(天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072)

安立生坦(Ambrisentan)是一种口服选择性内皮素受体拮抗剂，化学名为(+)-(2S)-2-［(4，6-二甲基嘧啶-2-基)氧］-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸，是目前世界上用于治疗肺动脉高压症的有效药物［1-2］。安立生坦是一种手性药物［3］，以S 活性构型具有治疗作用［4-5］，其合成工艺有多种，一种为二苯甲酮经Darzens 反应、醇解、亲核取代和水解等反应，得到安立生坦的消旋体，再经过拆分得到光学活性的安立生坦，该方法成本较高［6-7］;一种为二苯甲酮经Darzens 反应，醇解、水解、(S)-对氯苯乙胺拆分、缩合，得到光学纯度的安立生坦，此法所用拆分剂基因毒性大［8］。本实验用L-脯氨酸甲酯代替第二种方法中所用拆分剂，拆分效果相似，不仅降低了可能存在的生物毒性，而且节约成本。产物进行质量分析来监控安立生坦原料药的质量情况，此时L-脯氨酸甲酯就作为相关杂质应被进行检测，使其符合原料药杂质限度要求［9］。由于L-脯氨酸甲酯作为杂质含量较少，且其结构中只有一个发色团羰基，所以使用常规的紫外检测器很难检测到。

4-氯-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑(NBD-Cl)是一种活性卤类荧光试剂，几乎能跟所有伯胺和仲胺类化合物反应，其衍生速率较快，副产物少，衍生条件温和，衍生产物的最大激发波长为480 nm［10-11］。根据这个性质，NBD-Cl 可与L-脯氨酸甲酯中的仲胺进行衍生反应，其衍生产物带有荧光，使用灵敏度较高的荧光检测器进行检测［12］，从而达到对安立生坦原料药中的L-脯氨酸甲酯进行定量分析检测的目的。但安立生坦无荧光，需借助紫外检测器进行检测。

本研究建立了柱前衍生-高效液相色谱法，由紫外检测器串联荧光检测器检测安立生坦原料药中的手性拆分剂杂质L-脯氨酸甲酯的方法，能快速、简便有效地对杂质进行分析检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

安立生坦、L-脯氨酸甲酯，天津大学药物化学实验室提供，纯度均大于99.5%;NBD-Cl、甲醇、硼酸、磷酸三乙胺、无水磷酸氢二钠、氢氧化钠均为分析纯。

Agilent 1200 高效液相色谱系统，包括进样器G1329A，四元泵G1311A，真空脱气机G1322A，柱温箱G1316A，紫外检测器G1314B;RF-535 荧光检测器;Baseline C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);SENCO W201 恒温水浴锅;AS3120 超声仪;Milli-Q水净化系统。

1.2 色谱条件

Baseline C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1 mL/min，柱温40 ℃，紫外检测器波长为254 nm，荧光检测激发波长473 nm，发射波长534 nm，进样量20 μL。流动相A:甲醇，流动相B:磷酸氢二钠缓冲液(pH =6.5)，按照表1 进行梯度洗脱。

表1 流动相梯度洗脱溶剂程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3 溶液配制

1.3.1 L-脯氨酸甲酯溶液的配制 取L-脯氨酸甲酯适量，加入甲醇溶解，定容成0.25 mg/mL 的储备液。再精密移取1 mL 储备液置于100 mL 容量瓶，稀释至刻度，得到2. 5 μg/mL 的L-脯氨酸甲酯溶液。

1.3.2 安立生坦溶液的配制 取安立生坦适量加入甲醇溶解，定容成2.5 mg/mL 溶液。

1.3.3 衍生试剂溶液的配制 取NBD-Cl 适量，加入甲醇溶解，定容成3.0 mg/mL 溶液。

1.3.4 流动相缓冲溶液的配制 取1.42 g 无水磷酸氢二钠溶于500 mL 纯水中，超声溶解，加入50 μL三乙胺，再用磷酸调节pH 至6.5，制成20 mmol/L的磷酸氢二钠流动相缓冲液。

1.3.5 衍生反应缓冲溶液的配制 取1.86 g 硼酸溶于100 mL 水中，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节至pH=9，制成0.3 mol/L 的硼酸缓冲液作为衍生反应缓冲液。

1.4 柱前衍生化反应

取100 μL 2.5 μg/mL 的L-脯氨酸甲酯溶液、100 μL 3 mg/mL 的NBD-Cl 溶液、200 μL 衍生反应缓冲液(pH=9)置于棕色进样瓶中，补充600 μL 甲醇至1 mL 体系，用聚四氟乙烯带密封，超声3 min，置于60 ℃水浴中加热。60 min 后取出，置于冰水浴中冷却，停止反应。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的影响

2.1. 1 衍生反应温度的影响 分别在室温(23 ℃)、40，50，60，70，80 ℃下进行衍生反应(此时固定反应时间为30 min，衍生试剂加入量为100 μL 1 mg/mL 的NBD-Cl 溶液，缓冲溶液pH 为8)，记录荧光谱图中衍生产物的峰面积，结果见图1。

图1 衍生反应温度对衍生反应的影响Fig.1 Effect of derivatization temperature on derivatization reaction

由图1 可知，衍生产物的检测峰面积随温度的升高而逐渐增大，温度升至60 ℃时，峰面积有较明显增加，随后增加趋势减缓;而且本实验反应体系大部分为甲醇，甲醇的沸点为64 ℃，高于此温度时不利于体系稳定。所以，选定衍生反应温度为60 ℃。

2.1.2 衍生反应时间的影响 在反应温度60 ℃下，考察了反应时间120 min 内反应后进样分析，记录荧光谱图中衍生产物的峰面积，结果见图2。

图2 衍生反应时间对衍生反应的影响Fig.2 Effect of derivatization time on derivatization reaction

由图2 可知，衍生产物峰面积随反应时间的延长而逐渐增大，但60 min 后增加趋势逐渐缓慢。在保证检测灵敏度的基础上，应使反应更加方便快捷地完成，确定衍生反应时间为60 min。

2.1.3 衍生试剂加入量的影响 衍生试剂的加入量对于L-脯氨酸甲酯的反应完全程度有重要影响［13］，进而会影响其定量的准确性。保持衍生试剂浓度为1 mg/mL 时，分别加入0，10，50，100，300，600 μL 衍生试剂NBD-Cl 溶液，进行衍生反应(反应时间为60 min，反应温度60 ℃，衍生反应缓冲溶液pH 为8)，记录荧光谱图中衍生产物的峰面积，结果见图3。

图3A 表示荧光谱图中衍生产物的峰面积随衍生试剂加入量的变化情况，图3B 表示紫外谱图中衍生反应后剩余NBD-Cl 的峰面积，二者随衍生试剂加入量都呈现逐渐增大的趋势。为确保衍生产物检测的灵敏度，同时考虑反应试剂的充分利用，确定在反应体系中加入0.3 mg/mL 衍生试剂。

图3 衍生试剂加入量对荧光谱图中衍生产物(A)和紫外谱图中反应中剩余的NBD-Cl(B)的检测灵敏度的影响Fig.3 Effect of amounts of derivatization reagent on detection sensitivity of derivatization product in fluorescence detector and residual NBD-Cl in ultraviolet detector

2.1.4 衍生反应缓冲液pH 的影响 在pH 5.0 ～10.0 的范围内，考察衍生反应缓冲液对衍生反应的影响，结果见图4。

由图4 可知，在pH 5.0 ～9.0 之间，随着pH 的升高，衍生试剂NBD-Cl 的反应活性增加，衍生产物峰面积逐渐升高;当pH 由9.0 升至10.0 时，产物峰面积明显下降，这是因为随着碱性增强，衍生试剂发生水解，反应活性减弱。综合上述结果，确定衍生反应缓冲溶液pH=9.0。

图4 衍生反应缓冲液pH 值对衍生反应的影响Fig.4 Effect of pH of derivatization buffersolution on derivatization reaction

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性 分别将L-脯氨酸甲酯样品及未加入样品的空白对照进行柱前衍生化实验，色谱分析结果见图5。

图5 专属性对比谱图Fig.5 Chromatograms of the method specificity test

由图5 可知，在L-脯氨酸甲酯衍生产物出峰处，没有其他杂质干扰，峰形较好，专属性较高。

2.2.2 检测限和定量限 将L-脯氨酸甲酯样品溶液逐级稀释，分别以信噪比的3 倍和10 倍，确定L-脯氨酸甲酯的检测限和定量限。最后将检测限定为2.5 ×10－3μg/mL，定量限为7.5 ×10－3μg/mL。2.2. 3 线性与范围 将L-脯氨酸甲酯溶液(2.5 μg/mL)逐 级 稀 释 为 安 立 生 坦 浓 度(2.5 mg/mL)的0. 3%，0. 2%，0. 15%，0. 10%，0.05%，0.025%，分别进行衍生反应后，记录色谱分析衍生产物荧光峰面积，进行线性回归，得线性方程为y=1E +06x +271.78(R2=0.999 4)，线性范围为0.625 ～7.5 μg/mL。

2.2.4 重复性实验 平行测定6 个L-脯氨酸甲酯衍生反应样品，记录衍生产物色谱峰面积，计算RSD 值为0.33%，表明此方法重现性良好。

2.2. 5 加样回收率 移取安立生坦溶液(2.5 mg/mL)各100 μL 置于9 个棕色瓶中，分别加入3 个浓度水平的L-脯氨酸甲酯，制得L-脯氨酸甲酯浓度为安立生坦的0.05%，0.10%，0.15%的溶液各3 个。分别进行衍生反应后，记录色谱分析衍生产物荧光峰面积，按照标准曲线计算每个浓度下的回收率、平均回收率及精密度RSD，结果见表2。

表2 加样回收率、平均回收率及精密度RSD Table 2 Recoveries，average recoveries and RSD

2.2.6 方法耐用性 在色谱条件(流速、柱温、流动相缓冲液pH、流动相初始比例)稍作改动的情况下，测定衍生反应后的产物生成量，考察衍生产物出峰的保留时间、理论塔板数、拖尾因子及分离度的变化情况，结果见表3。

由表3 可知，这些微小变化对各评价参数影响不大，说明该方法具有很好的耐用性。

表3 耐用性考察数据Table 3 Data of ruggedness tests

续表3

2.2.7 L-脯氨酸甲酯溶液的稳定性 配制L-脯氨酸甲酯溶液(2.5 μg/mL)溶液，室温放置，在48 h内取样进行衍生反应［14］，进行色谱分析，计算衍生产物峰面积的RSD。三次进样峰面积RSD 为1.1%，说明样品在48 h 内可以稳定存在。

2.2.8 衍生产物的稳定性 加入100%甲酯进行衍生反应后，将同一衍生反应在9 h 内进样分析，观察峰面积的变化，结果见表4。

表4 衍生产物峰面积变化率Table 4 Change rate of peak area of derivatization product

由表4 可知，随着放置时间的增加，衍生反应峰面积略有增加。原因可能为由于体系进样后不再处于密封状态，反应体系中的甲醇不可避免会有挥发而导致液体体积减小，衍生产物浓度增大，再次进样相同体积，得到的峰面积会稍有变化，但变化程度很小，不影响对L-脯氨酸甲酯的定量分析。结果说明衍生产物在反应后9 h 内较为稳定，所以进行液相分析应尽量在衍生反应后9 h 内。

3 结论

通过对衍生化条件和色谱条件进行优化，首次建立了以NBD-Cl 作为衍生试剂的柱前衍生化-反相高效液相色谱测定法，用于检测安立生坦原料药中残余的手性拆分剂L-脯氨酸甲酯，该方法简单易行，重复性好，灵敏度高，适用于安立生坦杂质限量的检测。

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