热性惊厥患儿白细胞介素—6基因多态性分析及血清神经元特异性烯醇化酶水平的研究

吴晖等

[摘要] 目的 探讨白细胞介素-6（IL-6）基因多态性及血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平与小儿热性惊厥（FS）的关系。 方法 选择2011年6月～2013年4月江西省儿童医院收治的FS患儿90例为FS组，同期门诊健康体检儿童70例为对照组。采用PCR/RFLP对FS组与对照组小儿的IL-6基因的-572位点基因进行分析；同时采用ELISA法对患儿的NSE进行测定。 结果 IL-6基因-572位启动区-572位点存在C→G单核苷酸替换多态性，在FS组与对照组间分布差异有统计学意义（P < 0.05），FS组-572位点G等位基因频率均显著高于对照组（P < 0.05）；FS组NSE水平明显高于对照组（P < 0.01）。 结论 IL-6基因-572C/G多态性可能是儿童FS发病的遗传危险因素之一；惊厥患儿易发生脑损伤，应尽早检测血清NSE，且尽早进行干预治疗。

[关键词] 热性惊厥；白细胞介素-6 ；基因多态性；神经元特异性烯醇化酶

[中图分类号] R720.597 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（c）-0051-03

Study on the IL-6 polymorphism and NSE level in children with febrile seizures

WU Hui1 ZHANG Wuqiang1 LI Jun2 XU Nanping1 KE Jiangwei1

1.Department of Emergency， the Children's Hospital of Jiangxi Province， Nanchang 330006， China； 2.Department of Pediatrics， the People's Hospital of Ruichang City， Jiangxi Province， Ruichang 332200， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between interleukin-6 （IL-6） polymorphism and neuron specific enolase （NES） level in children with febrile seizures （FS）. Methods From June 2011 to April 2013， in the Children's Hospital of Jiangxi Province， 90 children with FS were selected as FS group， at the same time， 70 healthy children were selected as the control group. IL-6 gene -572 local gene of two groups was analyzed by PCR/RFLP； at the same time， NSE of FS group was measured by ELISA. Results the promoter region of the-572 site of IL-6 gene-572 lacal showed C→G single nucleotide substitution polymorphism， the difference of distribution between two groups was statistically significant （P < 0.05）， G allele frequency of -572 lacal in FS group were significantly higher than that in the control group （P < 0.05）； NSE level in FS group were significantly higher than that in the control group （P < 0.01）. Conculsion The IL-6 gene-572C/G polymorphism may be one of the genetic risk factors of children FS disease； FS children can be prone to brain injury， early detection of serum NSE， and early intervention.

[Key words] Febrile seizures； Interleukin-6； Polymorphism； NSE

热性惊厥（febrile seizures，FS）是小儿时期最常见的惊厥性疾患，常见于6个月～5岁，发病率为3%～8%。热性惊厥症状表现为患儿高热，全身性抽搐，持续时间较短，抽搐时意识丧失，严重情况可转变为癫痫、继发智力低下和行为异常，对幼儿的身心健康造成严重威胁，患儿常常有家族史[1-2]。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是由淋巴细胞和非淋巴细胞产生，是一种多功能的细胞因子，参与机体调节免疫应答和炎性反应等。研究报道FS患儿血清IL-6水平显著增高，而其基因启动子区域中-572C/G多态性是影响IL-6的重要因素[3-5]。IL-6基因-572C/G多态性可能是中国汉族儿童FS发病的遗传危险因素之一。谢晓丽等[5]报道神经元特异性烯醇化酶（NSE）是FS分型及预后评估的有价值生化指标之一，能一定程度反映FS后脑损伤程度。本研究以江西省儿童医院住院治疗的FS患儿为研究对象，探讨IL-6基因启动子区域中-572C/G多态性及血清神经元特异性烯醇化水平与FS的相关性，从基因水平为探讨小儿热性惊厥发病机制提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择江西省儿童医院2011年6月～2013年4月诊治的FS患儿90例，为FS组，诊断标准参考《儿科学》第7版。根据《小儿神经系统疾病》提出的分型标准[6]：单纯型：起病在6个月～4岁，高热后很快出现惊厥，惊厥持续5～10 min，惊厥发作为全身性、两侧性，发作前后神经系统正常，热退后1周脑电图正常；复杂型：起病于任何年龄，可在6个月以内或6岁以上，低热时出现惊厥，惊厥持续时间超过20 min，热性惊厥复发5次以上，惊厥呈明显限局性或明显左右不对称，有神经系统异常体征，有脑外伤或脑缺氧史，热退1周后脑电图正常。90例患儿中单纯型热性惊厥63例，复杂型热性惊厥27例，所有患儿发作期间查脑电图基本正常，排除有癫痫样放电或弥漫性异常改变患者。其中男51例，女39例，平均年龄（3.6±1.3）岁；上呼吸道感染者52例，支气管炎17例，支气管肺炎11例，肠炎9例，细菌性痢疾1例。另选择同期健康体检儿童70例为对照组，排除有抽搐发作史和其他神经系统疾病史，其中男38例，女32例，平均年龄（3.8±1.2）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过，家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实验仪器 PCR扩增仪（PCT-200型，BIO-RAD公司），琼脂糖电泳仪（SUB-CELL型， BIO-RAD公司），凝胶成像仪（Universal Hood Ⅱ型， BIO-RAD公司），离心机（Centrifuge 5702型， Eppendorf公司），生物清洁工作台（BSC-1500ⅡBC-X型， BIOBSE公司），酶标仪（RT-2000C型，成都贝斯达仪器有限公司）。

1.2.2 实验试剂 PCR扩增试剂盒（编号SK2492，上海生工生物工程有限公司）；限制性内切酶（编号R0102L，New Englang Biolab公司）；引物（上海生工生物工程有限公司），NSE酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒（批号fk0163Y，上海科兴商贸有贤公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 IL-6基因型的测定 FS组和对照组分别空腹取外周静脉血3 mL，将其中1 mL抗凝后转移至微量管，放置于-70℃冰箱保存；剩余2 mL置于普通试管中，标本采集后立即离心，置于-70℃冰箱保存。采用PCR/RFLP法进行基因型检测并摄片，并采用PCR/RFLP对FS组与对照组的患儿IL-6基因的-572位点基因进行分析。

1.3.2 血清NSE测定 采用ELISA法分别测定FS组惊厥发作后血清NSE值，其中对照组仅测1次。①包被液稀释抗原后，加50 μL于反应孔、分别加入FS组和对照组试样50 μL于反应孔内，再立即加入50 μL的封闭液。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min。②甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡3 min，甩去清洗液，拍干，重复3次。③每孔加入80 μL的亲和链酶素，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min。④甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡3 min，甩去清洗液，拍干，重复3次。⑤每孔加入工作液各50 μL，轻轻振荡混匀，37℃温育40 min，避免光照。⑥取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，加入终止液后应立即测定结果。ELISA读板仪读取450 nm波长处测定各孔的OD值。由江西省儿童医院生化业检验师检测。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-6基因多态性测定结果

两组所有研究对象均成功测出基因型。IL-6基因启动区-572位点存在C→G单核苷酸替换多态性，G等位基因和C等位基因。FS组与对照组相比，基因型频率在两组间的分布差异有统计学意义（P < 0.05）。对照组CC基因型频率显著高于病例组（P < 0.05），IL-6基因-572位点基因型和等位基因频率在FS组与对照组间分布差异有统计学意义，FS组-572GG基因型G等位基因频率均显著高于对照组（P < 0.05）。见表1。

2.2血清NSE测定

FS组血清NSE含量[（8.83±1.52）μg/L]明显高于对照组[（3.92±1.34）μg/L]，差异有高度统计学意义（P = 0.008）。

3 讨论

流行病学已证明，热性惊厥有家族聚集性，具有明显的遗传倾向。家族性热性惊厥占FS儿童25%～40%，其遗传方式曾有单基因常染色体显性、隐性和多基因遗传等多种机制，倾向于单基因常染色体显性遗传方式。经热性惊厥多病例家系分析发现多数热性惊厥呈常染色体显性遗传伴不完全性外显性，已发现数个染色体位点和许多基因与其相关。

IL-6具有调节免疫应答、参与炎性反应等多种功能，是中枢神经系统调节机体抗损伤防御的重要介质。袁红霞等[7]研究发现IL-6在患儿体内有明显的升高，与单纯发热患儿比较，FS患儿的含量更高，提示IL-6和小儿热性惊厥的发病存在一定的关联，且IL-6在热性惊厥发热过程中有一定作用。研究发现IL-6基因-572位点等位基因G组的血浆IL-6水平高于等位基因C组[8-13]，IL-6基因存在多种单核苷酸基因多态位点，主要位于启动区，这些单核苷酸多态性（SNP）与FS的发生密切相关[14-18]。本研究通过在基因水平上探讨IL-6基因-572C/G多态性及与小儿热性惊厥的关系。FS患儿与对照组儿童IL-6基因-572位点多态性分析，发现IL-6基因-572C/G多态性在两组间的分布差异有统计学意义（P < 0.05）。FS组GG基因型比例明显高于对照组，而对照组CC基因型比例明显高于FS组，进一步证实了小儿FS与IL-6相应SNP存在关联性，为FS易感人群早期识别、预后分析提供进一步的临床实验数据。

NSE是神经元损伤的敏感性标志物，其高低可直接反映脑组织受损程度，故NSE是检测脑神经元坏死的客观指标，通过NSE来估价单纯性与复杂性FS后脑细胞损伤情况，有助于其预后判断及预防性抗惊厥药的使用[19-21]。本研究结果表明，FS组NSE含量显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），表明FS患儿存在一定程度的脑组织的损伤，从而使患儿血清及脑脊液NSE水平明显增加。因此尽早检测血清NSE水平，积极地预防和保护中枢神经系统，有利于进行尽早干预治疗。检测NSE方法简便，可以为临床采取针对性措施提供有利帮助，检测同时需要注意如果检测样品放置太久，否则会影响检测结果，因而检测样品采集后需要及时送检。

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（收稿日期：2014-08-11 本文编辑：苏 畅）