绿木霉T43发酵液不同菌剂剂型的制备及野外应用

邓勋，宋小双，尹大川，宋瑞清

(1．黑龙江省林业科学院森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040;2．东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

樟子松Pinus sylvestris var．mongolica是我国北方主要造林树种，在生态建设、环境修复方面发挥重要作用［1］。樟子松枯梢病是由松球壳菌Sphaeropsis sapinea(Fr．)Dyko et Sutton引起的一种传染性病害，发生普遍、危害大，严重时可导致松林大面积死亡，目前主要以化学防治为主。该病属于寄主主导性病害，应以提高寄主抗性及降低病原菌种群数量为主要防治方向［2］。木霉菌Trichoderma spp．是自然界中资源丰富的拮抗微生物，具有抗菌谱广、适应性强和多机制性的特点。木霉的生物防治机理包括竞争作用、重寄生作用，以及产生挥发性或非挥发性的抗菌类物质对多种病原菌的抑制作用，此外，木霉菌株可定殖于植物根际，与植物根系形成共生体，改变植物的代谢功能，表现在促进植物生长［3］、增加养分吸收利用效率［4］、提高农作物产量以及诱导植物产生抗逆性等方面［5-6］。因此筛选开发有效控制樟子松枯梢病的木霉菌株及其制剂产品，对保持樟子松林微生态环境的稳定、有效控制枯梢病的发生、减少化学农药的使用具有重要意义。应用木霉菌剂在林业、药用植物、农业［7-8］以及花卉病害的生物防治中均取得了显著效果，并且世界上有多种木霉商品化菌剂问世，在生物防治药剂市场占据重要地位。

绿木霉T43课题组从以色列引进的1株广谱高效木霉菌株，对多种林木病原菌包括樟子松枯梢病菌、杨树烂皮病菌Cytospora chrysosperma、杨树叶枯病菌Alternaria alternata、沙棘干缩病菌Fusarium sporotrichoides、苗木立枯病菌Rhizoctonia solani，Fusarium oxysporum，Pythium debaryanum、松烂皮病菌Cenangium ferruginosum均有较好的抑制效果，抑菌谱广泛，其发酵液及乙酸乙酯提取物对松球壳孢菌室内生长抑制率分别为92．94%和90．58%，病原菌菌丝生长稀疏或完全停止生长，说明绿木霉T43在液体发酵过程中，可以代谢出多种抑菌活性成分。在以绿色木霉菌分生孢子和抑菌活性成分制备菌剂的野外应用中，对针叶苗木立枯病和樟子松枯梢病均取得了良好的防治效果，同时对针叶苗木还具有促生作用［9-13］。

本文在前期研究的基础上，从商品化菌剂的研制开发角度出发，对绿木霉T43发酵液的水剂和粉剂剂型的制备工艺进行研究和优化，同时测定其最佳的保存温度和保存周期，并对樟子松枯梢病的防控进行了野外应用试验，以期开发出适合林木病害生物防治的可规模化制备的高效生防菌剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料木霉菌株为绿木霉Trichoderma virens T43，从以色列引进，抑菌谱测定表明对多种林木病原菌具有高效的抑制作用，保存于东北林业大学林学院森林微生物实验室。

病原菌株为樟子松枯梢病病原菌—松球壳菌Sphaeropsis sapinea(Fr．)Dyko et Sutton，自辽宁省固沙研究所章古台实验林场樟子松人工林内感病樟子松上分离，保存于东北林业大学林学院森林微生物实验室。

培养基成分:(1)改良PDA培养基。马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉17 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1．5 g/L。(2)PD培养基。马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，Mg-SO4·7H2O 1．5 g/L。(3)发酵罐用培养基。蛋白胨11 g/L，葡萄糖6 g/L，KH2PO410．5 g/L，CaCl20．8 g/L，MgSO4·7H2O 0．6 g/L，(NH4)2SO413 g/L，FeSO4·7H2O 5．0 mg/L，ZnSO4·7H2O 1．4 mg/L，CoCl2·6H2O 3．7 mg/L，MnSO4·H2O 1．6 mg/L。

仪器设备:HZQ-F100恒温振荡摇床，杭州海业HYSS-1050 50 L发酵罐，HPG-400H生化培养箱，SW-CJ-2F超净工作台，FA2004N电子分析天平，QFN-D-1型全自动高压灭菌锅，奥林巴斯CX21生物显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 不同木霉发酵液菌剂剂型的制备 发酵种子液的制备:将活化的绿木霉菌块接种到含有PDA培养基斜面的克氏瓶中，25℃黑暗条件下恒温培养7 d后，用无菌水冲洗下分生孢子，将孢子液浓度稀释到104个孢子/mL，作为发酵接种的种子液。

不同发酵液的制备:分别采用实验室摇瓶发酵和发酵罐发酵两种方法制备发酵液。(1)摇瓶发酵液。取2．5 mL孢子悬浮液接种于250 mL(500 mL三角瓶)PD液体培养基中，150 r/min，25℃恒温震荡培养5 d，4℃保存备用。(2)发酵罐发酵液。采用50 L发酵罐优化条件，1 t发酵罐进行中试生产，使用发酵罐用培养基，装料系数60%，转数150 r/min，发酵温度28℃，通气比1∶1，既通气量为1．8 m3/h、初始pH7．0、培养周期120 h(5 d)，4℃保存备用。

发酵液菌剂水剂的制备:在摇瓶发酵和发酵罐发酵的两种发酵液去除大块固形物后，加入3‰的苯甲酸钠，并用浓盐酸将pH值调至4．0后加入适量的聚三氧硅烷、OP-10、抗氧剂BHT以及抗紫外剂等，制备成发酵液水剂。其中摇瓶发酵液为A1，发酵罐发酵液为A2。

发酵液菌剂干粉剂的制备:发酵罐发酵液去除大块固形物后，加入5%轻质碳酸钙、3%糊精，采用喷雾干燥的方法干燥。进风温度140～170℃，出风温度80℃。喷雾干燥后得到原粉，再加入茶皂素、白炭黑、抗氧剂BHT、抗紫外剂UV531、高岭土等制备成发酵液干粉剂。进风温度140～170℃设高、低两档，制备成两种原粉，即菌剂A3(低温干燥)和A4(高温干燥)。

1.2.2 菌剂抑菌效果的室内测定 采用菌丝生长抑制法测定抑菌率［14］。

水剂处理:将2种水剂(A1和A2)10 000 r/min离心10 min后取上清液，用0．22μm滤头过滤除菌后加入PDA培养基中，摇晃均匀，使其浓度分别达到10，20，30，50倍，倒平板，待冷却凝固后备用。

干粉剂处理:将两种干粉剂(A3和A4)按照质量比1∶10加入到无菌水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，将悬浮液10 000 r/min离心10 min后取上清液，用0．22μm滤头过滤除菌后倒入PDA培养基中，摇晃均匀，配制成浓度梯度为200，500，1000，2000倍，倒平板，待冷却凝固后备用。

在上述准备好的平板中接入樟子松枯梢病病原菌，以不添加菌剂的PDA平板作对照，25℃恒温培养5 d，采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算对病原菌生长的抑制率，每处理3次重复。

生长抑制率(%)=(对照菌落半径-处理菌落半径)÷对照菌落半径×100

1.2.3 木霉菌剂保存温度及保存期测定 菌剂经过不同时间、不同温度保存后，抑菌效果测定方法采用［14］。

保存温度:分别将制备好的菌剂4种剂型放置于4，25，30℃条件下储存6周后取样测定。

保存时间:分别将制备好的4种剂型放置在25℃条件下，保存5，10，30，60，90，180 d分别取样测定。

1.2.4 不同剂型对樟子松枯梢病的野外防治 野外防治基地为辽宁省固沙所章古台实验林场樟子松人工林，位于辽宁省阜新市彰武县章古台镇。樟子松林龄25 a，胸径15 cm，树高15 m，枯梢病发病率70%以上，早期进行过化学药剂防治，近5 a没有人为干扰，适合进行生物防治。

防治试验设计:采用以绿木霉T43发酵液为主要成分的4种剂型(A1，A2，A3，A4)，分别在2012年6月1日、6月20日和7月10日进行3次野外防治樟子松枯梢病试验。

试验设樟子松枯梢病的预防小区(未发病，病情指数0)、防治小区(发病)和对照区，每个小区60株樟子松。菌剂规格为水剂80 L/桶，干粉菌剂200 g/袋。将水剂A1和A2分别用水稀释10倍，干粉菌剂A3和A4稀释1000倍，采取活塞式压力推进器进行树冠喷雾的方式施药，以喷施清水作对照。每个处理3次重复，小区随机排列。

防治效果调查:喷药前调查小区樟子松的病害等级，计算病情指数。喷药30 d后，对预防和防治区分别调查，每个处理重复调查100株树，计算病情指数和防治效果。将樟子松枯梢病发病等级划分为4级(表1)，病害损失估计采取分级计数法，以病情指数表示发病程度。

病情指数=∑(病级株数×代表数值)÷(株数总和×最重一级代表数值)×100

防治效果(%)=(对照区病情指数-防治区病情指数)÷对照区病情指数×100

表1 樟子松枯梢病发病等级划分标准

1.2.5 数据分析 测定和调查数据用统计软件SPSS 13．0采用Duncan方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 木霉发酵液菌剂不同剂型的制备

2.1.1 木霉发酵前后变化 分别采用摇瓶发酵和发酵罐发酵两种方法制备绿木霉T43的发酵液，两种发酵方法发酵前后参数变化见表2，3。比较两种不同的发酵方式，发酵罐由于可以通氧保持罐体内的空气流通，120 h发酵后，菌丝产量(6．0%)高于摇瓶发酵(4．5%)，同时可产生分生孢子。

对于《红楼梦》中的儿化词，海洋女士曾做过粗略统计，仅《红楼梦》前八十回，儿化词就出现了一千次左右(包括重复使用)，平均每回达十多次，总条目达440条之多；仅第7回、24回、28回等，就各出现过80个以上，《红楼梦》中儿化词数量之多，由此可见一斑。

表2 摇瓶发酵前后发酵液参数变化

表3 50 L发酵罐发酵前后参数变化

2.1.2 木霉菌不同剂型的制备工艺 制备工艺优化后，得到木霉发酵液水剂和干粉粉剂的制备工艺。

绿木霉T43发酵液水剂制备工艺:绿色木霉发酵液过滤去掉大块固形物后，使用HCl调整pH值到4．0，按下列配方制备成绿木霉T43抑菌活性成分水剂剂型:发酵液40%～60%，聚三氧硅烷0．5%～1．5%、OP-10 0．5%～1．5%、抗氧剂BHT 0．1%～0．3%、抗紫外剂UV531 0．2%～0．5%，3‰苯甲酸钠，用无菌水补足100%。

绿木霉T43发酵液干粉剂:采用喷雾干燥的方法，在发酵液中加入4．0%～7．0%轻质碳酸钙、3．0%～5．0%糊精，进风温度130～170℃，出风温度80～90℃，喷雾干燥后得到原粉。按下列剂型配方制备成绿木霉T43抑菌活性成分干粉剂剂型:原粉50%～60%、茶皂素5．0%～7．0%、白炭黑5．0%～7．0%、抗氧剂BHT 0．15%～0．3%、抗紫外剂UV531 0．2%～0．4%、高岭土补足至100%。

2.2 室内测定的菌剂抑菌效果采用菌丝生长抑制法对不同剂型菌剂的抑菌能力进行的生物测定结果表明，4种剂型在不同稀释倍数的处理中抑菌效果差异显著，其中水剂A2的10倍液抑菌效果最好，达到64．58%，水剂在10倍和20倍，粉剂在500倍和1000倍对樟子松枯梢病菌均有明显的抑制作用，随着稀释倍数的增加，抑菌效果逐步减弱(图1，2)。不同菌剂剂型之间比较，水剂效果好于粉剂。

相同剂型之间比较，相同条件下，水剂A2效果好于A1，分析原因，在发酵罐液体发酵条件下，由于有通氧条件存在，可以促进菌丝的生长，从而提高抑菌活性成分的代谢水平，提高相同体积发酵液中抑菌活性成分的含量，增加其抑菌率。

两种粉剂A3和A4之间比较，A3抑菌效果好于A4，分析原因，菌剂A3的干燥温度低于A4，较低的温度可以降低发酵液中抑菌活性成分的失活率，制备成的菌剂可以更加有效抑制樟子松枯梢病菌的生长。

图1 木霉菌水剂的抑菌作用

图2 木霉菌干粉剂的抑菌作用

2.3 木霉菌剂保存温度及保存期测定生物菌剂的保存温度高低和保存期长短是决定该剂型是否具有商品化潜力的重要因素，本研究对绿木霉T43的4种剂型的保存温度(图3)测定中，随着保存温度的升高，4种剂型不同程度的出现抑菌效果下降，水剂A1和A2在4℃和25℃条件下，保存6周后，抑菌效果均保持在50%以上，抑菌效果差异不显著;干粉剂对温度变化比水剂敏感，3个保存温度对干粉剂抑菌活性的影响存在显著性差异;初步判断4种剂型在室温条件下(25℃)可以有效保存。

随着保存时间的延长，菌剂的抑菌活性逐步降低，180 d后，4种剂型菌剂的抑菌效果下降到了20%左右。综合保存温度和保存时间的分析，绿色木霉T43的水剂剂型更适合长期保存(图4)。

图3 不同保存温度对菌剂活力的影响

图4 不同保存时间对菌剂活力的影响

2.4 不同木霉菌剂剂型对樟子松枯梢病的野外防治4种木霉菌剂型对樟子松枯梢病野外防治试验结果显示，各处理对樟子松枯梢病均有一定的预防和控制效果，不同菌剂类型处理间差异显著，而两种干粉菌剂对樟子松枯梢病的控制效果没有显著性差异，均高于72%，对于樟子松枯梢病的预防和控制，水剂效果均高于粉剂，水剂控制效果A1为78．88%，A2最好，为81．66%，4种剂型对樟子松枯梢病的预防效果均在50%左右(表4)。

表4 木霉菌剂不同剂型对樟子松枯梢病的防治效果

3 结论

绿木霉T43是引进的高效木霉菌株，本文对绿木霉T43的不同剂型制备工艺、保存条件以及对樟子松枯梢病防治的野外应用进行了研究，室内生物测定结果表明，采用发酵罐制备的发酵液其抑菌效果好于摇瓶发酵，发酵罐液体发酵菌丝生长旺盛，抑菌活性成分代谢水平更高;不同菌剂剂型之间比较，发酵液水剂剂型抑菌效果好于干粉剂型，同时水剂剂型更有利于保存，在室温条件下有效抑菌水平可以保存90 d以上。

在野外防治应用中，各处理对樟子松枯梢病均有一定的预防和控制效果，不同菌剂类型处理间差异显著，对于樟子松枯梢病的预防和控制，水剂效果均高于粉剂。

目前木霉菌剂主要以分生孢子可湿性粉剂为主，木霉菌代谢产物中抑菌活性成分的菌剂研制和开发还有待深入研究。

［1］ 邹良，孟庆超．东北内蒙地区樟子松病害及防治［J］．防护林科技，1995，2:42-44．

［2］ 黄敬林，张力．樟子松枯梢病研究进展［J］．东北林业大学学报，2005，33(2):83-85．

［3］ Harman G E，Howell C R，Viterbo A，et al．Trichoderma speciesopportunistic，avirulent plant symbionts［J］．Nature Review Microbiology，2004，2:43-56．

［4］ Francesco V，Krishnapillai S，Emilio Ghisalberti L，et al．Trichoderma plant-pathogen interactions［J］．Soil Biology＆Biochemistry，2008，40(1):1-10．

［5］ Hanson L，Howell C．Elicitors of plant defense responses from biocontrol strains of Trichoderma virens［J］．Phytopathology，2004，94:171-176．

［6］ Vinale F，Sivasithamparamb K．A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants［J］．Physiological and Molecular Plant Pathology，2008(72):80-86．

［7］ 杨春林，席亚东，刘波微．哈茨木霉T-h-30对几种蔬菜的促生作用及病害防治初探［J］．西南农业学报，2008，21(6):1603-1607．

［8］ Vinale F，Ambrosio G，Abadi K，et al．Application of Trichoderma harzianum(T22)and Trichoderma atroviride(P1)as plant growth promoters，and their compatibility with copper oxychloride［J］．Journal of Zhejiang University Science，2004，30:2-8．

［9］ 李冲伟，杨立宾，宋瑞清．木霉菌株对金黄壳囊孢菌的抑菌效应及机理［J］．林业科学，2012，48(9):88-94．

［10］ 尹大川，邓勋，宋瑞清，等．引进木霉菌株T43对立枯病的抑制效益及对苗木的促生作用［J］．中国森林病虫，2012，31(4):1-5．

［11］ 邓龙，尹大川，宋瑞清．木霉菌株TC-14对苗木立枯病菌的室内外抑制效果［J］．黑龙江生态工程职业学院学报，2012，25(4):33-34．

［12］ 邓勋，宋瑞清，尹大川，等．高效木霉菌株对樟子松枯梢病的抑制机理［J］．中南林业科技大学学报，2012，32(11):21-27．

［13］ 杨立宾，宋瑞清，李冲伟．哈茨木霉菌株T28发酵液乙酸乙酯提取物对致病疫霉的抑制及对体内酶活性的影响［J］．林业科学，2013(3):110-115．

［14］ Sunil C，M Suresh，B Singh．Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f．sp．ciceris for integrated management of chickpea wilt［J］．Biological Control，2007，40(1):118-127．