间歇低氧对大鼠肝糖原的影响及Tempol的干预作用

孔铖英 陈宝元 赵海燕

(1.浙江大学医学院附属第四医院呼吸内科 浙江义乌 322000;2.天津医科大学总医院呼吸科 天津 300052)

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)是一种常见的睡眠呼吸疾病,表现为睡眠时反复发生上气道塌陷导致呼吸暂停和呼吸低通气,从而发生间歇性低氧血症(IH),导致多系统、多器官损害［1］。目前认为肥胖是OSAS的高危因素,且与OSAS合并代谢综合征密切相关［1-2］。肝脏作为人体体内的核心代谢器官,慢性间歇低氧血症对其的影响有待进一步研究。本研究研究建立不同频率间歇低氧组普通饮食大鼠模型及抗氧化剂干预模型,探讨OSAS模式CIH对大鼠肝脏组织损伤、肝糖原含量的影响及抗氧化剂Tempol的干预作用,从而为OSAS情况诱发肝脏损害、代谢紊乱的防治提供实验证据和理论基础。

1 实验动物及主要材料

成年雄性Wistar大鼠80只[SCXK(京)2006—0009],体重(200±15)g。伊红-美蓝染液(天津北方天医化学制品厂),糖原染色试剂盒(广州市俪科贸易有限公司),4-Hydroxy-Tempol,纯度>97%(美国SIGMA STBB3145)。

2 实验方法

2.1 模型制作及实验分组

48只大鼠均给予同种普通饲料喂养,每天低氧实验时间为9:00—17:00,共42天。实验过程中无大鼠死亡退出。建立间歇低氧模型[3]:通过计算机程控装置控制低氧/复氧循环,使暴露容器内O2浓度在5%－21%间循环,达到预置的低氧/复氧条件。采用随机排列表法分组(每组8只):(1)间歇低氧组(IH):按照设定的5%间歇低氧模式循环充入N2和空气,首先以10L/min充入N230秒,维持舱内O2浓度至最低5%,随后以10L/min充入压缩空气40秒,使舱内O2浓度从低氧状态恢复至正常(21%),维持以5L/min充人压缩空气维持常氧完成1个低氧周期。频率为20、40次/小时。(2)Tempol干预组及生理盐水干预组:选取预实验中肝组织病理改变最重40次/小时间歇低氧组进行干预,于暴露第28天干预至暴露结束,每天于暴露前15min,腹腔注射10%Tempol或生理盐水,剂量为1ml/kg体重。(3)间歇正常氧组(IA):按照30次/小时频率循环充人空气,使舱内O2浓度维持在21%。(4)空白对照组(CG):将实验动物置于普通饲养舱内42天。

2.2 肝脏组织学及肝糖原含量观察

暴露结束后各组大鼠均麻醉后股动脉放血处死,迅速解剖取相同部位肝组织(0.5cm*0.5cm)置于10%中性甲醛中固定,经过脱水、浸蜡、包埋、切片后,分别行HE和PAS染色,观察肝脏组织学变化及肝糖原含量情况。

3 结果

(1)肝脏HE染色图片见图1。IA和IH组均未见肝细胞内脂滴沉积,无明显炎症或肝纤维化。IA组肝脏肝板排列有序,肝细胞胞膜完整,胞浆丰富,胞核形态正常,无炎性细胞浸润(图1A)。20次/小时IH组肝脏组织学表现为肝脏肝板排列有序,肝血窦部分有增宽,细胞胞质稀疏,肝细胞轻度肿胀,部分胞核深染、固缩,但未见炎性细胞浸润及细胞坏死(图1B)。随着IH的频率增加,肝组织损伤有加重的趋势,40次/小时IH组可见明显肝血窦增宽,胞浆深染,未见细胞肿胀,未见空泡,胞核深染固缩,时可见细胞局灶性坏死,炎性细胞浸润(图1C)。40次/小时IH组抗氧化剂Tempol干预组肝组织学表现为肝板排列有序,肝细胞胞膜完整,胞浆丰富,无细胞水肿或炎性细胞浸润(图1D)。

(2)肝脏组织PSA染色图片见图2。IA肝组织含少量糖原(图2A);20次/小时IH组肝组织肝糖原含量明显增加(图2B);40次/小时IH组肝细胞糖原贮积进一步增加(图2C);间歇低氧40次/小时暴露第28天抗氧化剂Tempol干预组肝糖原明显减少(图2D)。

4 讨论

本研究发现单纯CIH可以引起Wistar大鼠肝脏损伤,且随着频率增加肝组织损伤加重,较高频率可致肝血窦增宽,肝细胞局灶性坏死及炎性细胞浸润,但始终未见肝纤维化,SOD类似物Tempol抗氧化干预后肝组织损伤明显减轻。结合我们之前的研究［4］,间歇低氧可致血清ALT、AST水平升高,且随着频率的增加肝酶水平进一步升高,抗氧化剂Tempol干预肝酶水平下降,而且抗氧化剂干预越早肝损伤血清学表现越轻。关于CIH引起肝损伤的机制,我们之前的研究［5］发现各间歇低氧组肝匀浆脂质过氧化代谢产物MDA水平升高,氧自由基清除剂SOD及总抗氧化能力T-AOC活性下降,证实IH大鼠模型中肝脏确实发生了氧化应激反应。综上所述,我们可以认为氧化应激损伤在OSAS模式CIH致肝损伤中起了重要作用,提示抗氧化剂可以OSAS患者肝损伤的情况。

图1 肝组织HE染色×400倍。

图2 肝脏PAS染色×400倍。

本研究还发现各间歇低氧组肝组织内肝糖原含量明显增加,这与Savransky等[6]研究一致。有学者曾报道1型糖尿病和血糖控制不理想的患者伴有肝脏糖原贮积[7－8],高血糖激活糖原磷酸化酶导致糖原合成增加[8]。我们研究中各间歇低氧组肝糖原含量明显增加,提示长期地间歇低氧导致大鼠体内糖稳态被破坏。

大鼠肝热缺血模型研究[9]发现,预防性地增加肝糖原贮备能拮抗热缺血再灌注损伤过程中肝储备功能的损害。Lavie et al认为OSAS模式CIH的间歇性的低氧/复氧类似于缺血/再灌注事件[10],低氧／复氧过程中发生了氧化应激。我们或许可以认为慢性间歇低氧所致肝糖原贮备增加是机体对拮抗反复低氧／复氧导致的氧化应激对肝储备功能的损害。

慢性间歇低氧导致普通饮食大鼠肝脏糖原含量增加,而SOD类似物Tempol抗氧化干预可使大鼠肝脏糖原含量恢复正常水平。Polak J等在OSAS模式间歇低氧小鼠模型研究［11］中发现14天的间歇低氧暴露导致小鼠肝糖原贮备增加50倍,肝糖原含量与空腹血糖相关联,而且发现间歇低氧暴露下肝葡萄糖的输出来自肝脏糖异生而非肝糖原分解,实现了葡萄糖输出增加的同时肝糖原贮备增加,解除间歇低氧暴露后小鼠肝糖原含量和空腹血糖水平可恢复正常,这与我们的研究吻合。抗氧化剂抗氧化治疗可以改善OSAS患者糖代谢紊乱。

Tempol是一种小分子生物膜透过性的超氧化物歧化酶(SOD)类似物,能直接清除活性氧。本研究发现抗氧化治疗能改善OSAS模式间歇低氧所致的肝损伤及肝脏糖糖原累积,从而改善机体糖代谢紊乱。OSAS为全身性疾病,抗氧化治疗能否改善多系统的损伤尚待进一步研究。

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