黄酒酸败组分的基源微生物初步研究*

陈乃东，胡平，陈晨

1(皖西学院 生物与制药工程学院，安徽六安，237012)

2(皖西中药与天然药物工程技术研究中心，安徽六安，237012)

3(安徽医科大学，安徽合肥，230032)

黄酒因酒精含量较低，在生产、陈化和贮运过程中易感染细菌而导致变酸甚至发臭，这种现象称为酸败，俗称“起醭”。酸败是我国黄酒业面临的头等难题［1-2］。轻度酸败既降低原料出酒率，又损害了黄酒应有的风味，直接影响了黄酒的品质。重度酸败时黄酒因变质而无法饮用，造成了大量的人力、物力损失，还会引发因清理困难而导致的环境污染［3-4］。酸败现象已成为困扰黄酒生产企业、使黄酒生产成本居高不下的主要技术难题之一［5］。

黄酒生产过程中灭菌不彻底、贮藏或运输过程中染菌等是导致酸败的主要原因，因此，确定导致黄酒酸败的基源微生物，进而采取针对性灭菌措施是减少黄酒酸败的有效方法。张遐耘［6］采用乳酸菌培养基对袋装黄酒中的杂菌进行了检测，认为乳酸杆菌属是引起袋装黄酒变浑浊的污染菌属。谢广发等［7］采用PCR和16S rDNA序列测定等分子生物学手段检测和分析了酸败不胀气袋装黄酒中的污染微生物，发现袋装酸败黄酒中的微生物主要是假单胞菌。毛青钟等［8］采用MRS培养基对黄酒仓库坛酒酸败微生物进行了分离鉴定，认为酸败黄酒中主要微生物是乳酸杆菌。这些研究为探讨黄酒酸败的基源微生物提供了很好的前期研究基础，但已有的研究只是对酸败黄酒的微生物组成进行鉴定，并未能确定导致酸败的基源微生物。

本实验运用高效毛细管电泳技术，通过分析酸败黄酒原酒与黄酒原酒的组分建立酸败黄酒原酒中酸败成分的检出方法，在此基础上，发酵培养从酸败黄酒中分离的微生物，运用建立的HPCE检测方法，检测酸败黄酒微生物发酵产物，通过比对二者的共有峰，追踪可能产生黄酒酸败成分的微生物。在生产过程中，根据导致酸败的微生物的习性，改进生产工艺，采取针对性灭菌或预防措施，抑制有害微生物侵入或生长，从而有效降低酸败的发生，降低黄酒生产成本。本实验为这些后续研究奠定了基础。

1 材料与试剂

1.1 仪器与设备

K1060型高效毛细管电泳仪，北京凯奥;42.8 cm×45 μm未涂层石英毛细管的毛细管，北京凯奥;TS-211B恒温摇床，上海天呈实验仪器有限公司;BKDM320奥特数码生物显微镜，重庆奥特;SW-CJ-1FB净化工作台，苏州净化设备有限公司;YM50FGN干燥内排型压力蒸汽灭菌器，上海三申;MJ-150-Ⅱ型霉菌培养箱，上海天呈实验仪器有限公司。

1.2 材料与试剂

黄酒原酒、酸败黄酒原酒于2013年4月26日从安徽禾裕黄酒集团有限公司生产车间随机抽取，每种样品抽取10个，分别采自不同陶罐，采回后于4℃冰箱保存、备用。

精密pH试纸，上海三爱思;H3BO3，上海实意化学试剂有限公司;NaH2PO4，南京化学四试剂一厂;四硼酸钠，新科电化剂厂;NaOH，陇西化工股份有限公司，均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 黄酒酸败组分HPCE检出分析条件

缓冲液、样品黄酒原酒、酸败黄酒原酒、微生物发酵产物，测定前以Na2CO3溶液调pH至10.0后，以0.45 μm纤维素膜过滤后备用。

通过反复预实验，确定黄酒原酒、酸败黄酒原酒检测条件为:pH 10.0的0.075 mol/L磷酸氢二钠-四硼酸钠、检测波长215 nm、分离电压8.0 kV。

进样前毛细管用缓冲溶液洗5 min左右，连续进样3～5次后及时更换新的分离缓冲溶液，以保证迁移时间和校正峰面积的重现性。

2.2 培养基

PDA-黄酒培养基:在复合马铃薯培养基(PDA)基础上，以黄酒原酒代替蒸馏水。去皮马铃薯200.0 g切成小块，黄酒原酒煮15.0 min，纱布过滤，滤液加入葡萄糖20.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g(或MgSO40.73 g)，VB1微量(10 mg)，加黄酒原酒定容至1.0 L。固体培养基加入2.0%的琼脂。121℃灭菌15 min，备用。

2.3 酸败黄酒原酒微生物分离及其发酵培养

采用固体PDA-黄酒培养基，平板划线法反复分离纯化培养酸败黄酒中的菌株;革兰氏染色后观测分离菌株孢子形态。

液体PDA-黄酒培养基发酵培养分离纯化得到的菌株。培养条件:150 mL三角瓶、每瓶30 mL液体PDA-黄酒培养基、两步活化法培养分离的菌株［9-11］、摇床转速180 r/min、温度28℃、培养6 d后取出，发酵液滤纸过滤后继以0.45 μm纤维素膜过滤，备用。

2.4 黄酒酸败基源微生物检出

采用2.1建立的方法检测发酵液，分析对比微生物发酵产物与黄酒原酒及酸败黄酒原酒的HPCE检测结果，确定导致黄酒酸败的可能基源微生物。

2.5 黄酒酸败基源微生物导致黄酒酸败性能的验证

将黄酒酸败基源微生物转接入未变质黄酒原酒中，采用2.3方法条件培养，HPCE对黄酒中的组分进行分析，以确定引起黄酒变质的微生物。

3 结果和讨论

3.1 黄酒酸败组份HPCE检出结果

在本实验条件下，检得10种黄酒原酒与10种酸败黄酒原酒样品成分HPCE模式图如图1所示。对比分析可见，黄酒各组分基本实现分离，各组分出峰时间主要集中在11.0～14.0 min(7个组分峰)和17.0～24.0 min(11个组分峰)。此外，7.0～9.0 min存在5个弱峰。多次重复测定，检测到黄酒原酒的物质峰数量、各组分的保留时间、峰面积等重现性良好，证明实验建立的黄酒原酒HPCE检测方法稳定性、重现性较好。

图1 黄酒原酒和酸败黄酒原酒的组分HPCE检测结果对比Fig.1 Comparison between yellow rice wine respondence to its rancid partener detected by established HPCE

相同条件下检测酸败黄酒原酒(图1)，与黄酒原酒对比分析其保留时间、相对峰位置、峰形，在11.0 min前，未检测到明显组分峰，在11.0～14.0 min只有3个峰(仅有1个为共有峰，TR=11.8 min)，17.0～24.0 min部分仅有2个共有峰(TR=22.4 min，23.6 min)及3个小峰。在27.0～31.0 min，增加了5个峰，在TR=46.3 min处，新增了1个较强的峰。酸败黄酒原酒与黄酒原酒HPCE检测结果存在显著差异。酸败黄酒原酒是在生产原料黄酒过程中混进有害微生物，其生长代谢消耗醪液中的营养物质，产生导致酸败的物质形成的。因此，酸败黄酒的HPCE图中新增的峰包含导致黄酒酸败的部分或全部物质，在11～27.0 min内缺失的共有峰代表有害微生物发酵所消耗的组分。这为进一步追踪黄酒酸败的基源——有害微生物提供了可能。

3.2 酸败黄酒原酒微生物分离结果

采用PDA-黄酒培养基、平板划线法，反复分离纯化培养后得到8株菌株，分别编号为OM-1～OM-8。其菌落形态及菌株细胞的形态如图2、图3所示。

图2 酸败黄酒原酒中分离的菌株菌落形态Fig.2 The microorganisms from the rancid yellow rice wine

图3 酸败黄酒原酒中分离的菌株细胞形态(放大1600倍)Fig.3 The microorganism from the rancid yellow rice wine

3.3 酸败黄酒微生物发酵产物HPCE检测结果

从酸败黄酒原酒中分离的菌株OM-1～OM-8，采用液体PDA-黄酒培养基，经摇瓶发酵培养，采用2.1构建的黄酒酸败组份HPCE检出方法分析其发酵产物的组分，结果如图4所示。在TR=27.0～31.0 min区间，菌株OM-1～OM-4、OM-6～OM-8发酵产物均未检出与酸败黄酒原酒的共有峰，表明菌株OM-1～OM-4、OM-6～OM-8不是导致黄酒酸败的可能菌株。菌株OM-5发酵产物中检测与黄酒酸败组分的共有峰peak1～peak5(图4)，而且共有峰peak1～peak4为酸败黄酒原酒相对于黄酒原酒的特征峰——可能的酸败组分HPCE色谱峰，提示菌株OM-5可能是导致黄酒酸败的关键微生物之一。

为了探讨OM-5菌株PDA-黄酒培养基发酵液检出的peak1～peak5与黄酒组分的相关性，将OM-5菌株接种至复合PDA培养基(不含黄酒)及牛肉膏蛋白胨培养基，在相同的条件下发酵培养6 d后，按2.1建立的HPCE分析方法检测发酵液的组分，结果如图5所示。在复合PDA培养基及牛肉膏蛋白胨培养基培养的OM-5发酵液中，未检测到酸败黄酒原酒特征指纹峰，进一步证明OM-5是产生酸败黄酒原酒酸败组分的菌株之一。

图4 酸败黄酒原酒分离菌株发酵液高效毛细管电泳检测结果Fig.4 The HPCE analysis on the fermentation broth of the eight microorganisms isolated from rancid yellow rice wine

图5 不同培养基培养的菌株OM-5发酵液高效毛细管电泳检测结果对比Fig.5 The HPCE analysis of the fermentation broth of OM-5 cultured with different mediums

3.4 黄酒酸败基源微生物导致黄酒酸败性能的验证结果

将OM-5接入未酸败的黄酒原酒，发酵培养6 d后，感官评价黄酒已酸败变质，HPCE检测结果如图6所示，OM-5菌株黄酒原酒发酵液出现了酸败组分峰，提示OM-5菌株是导致黄酒酸败的微生物之一。

4 结论与展望

由于黄酒发酵是一种特殊的不灭菌的开放式双边发酵［12］，环境、容器、工具等卫生差，往往会造成杂菌的侵袭，出现污染和感染，本研究结果表明在生产过程中染菌可能是导致黄酒酸败的主要原因之一。

在本实验条件下，酸败黄酒中可能的酸败物质峰，本实验对导致黄酒原酒酸败的产酸菌种类进行分离研究，共分离OM-1～OM-8八种菌株，HPCE检测结果表明，OM-5菌株可能是导致黄酒原酒酸败的主要菌株之一。研究结果对阐明黄酒生产过程中酸败的产生机制、建立预防黄酒酸败的质量控制方法及酸败预警系统提供参考依据。

图6 OM-5菌株黄酒原酒发酵培养液HPCE检测结果Fig.6 The HPCE analysis of the fermentation broth of OM-5 cultured with yellow rice wine

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