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鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶及B16黑色素瘤细胞的作用*

2014-11-20陈龙许光治高前欣周萌王姝倪勤学张有做

食品与发酵工业 2014年8期
关键词:鸡爪黑色素瘤酪氨酸

陈龙,许光治,高前欣,周萌,王姝,倪勤学,张有做

(浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室,浙江临安,311300)

在动物和人体内,黑色素的产生是一种自我保护机制,它是一种对紫外线吸收效果很好的吸收剂,能够有效地保护皮肤免受阳光辐射的侵害。但是,黑色素的合成属于人体黑色素细胞对外来侵害的一种应激反应,这种反应受到遗传,内分泌,紫外线刺激,饮食等因素的影响,如果反应过于强烈,则会导致人体黑色素代谢失调,积累量大于排泄量,造成皮肤过黑,甚至引起一系列皮肤病,严重者导致黑色素瘤的产生。在植物体内,多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类[1-2],目前市场上流行的黑色素合成抑制剂多数是通过抑制蘑菇酪氨酸酶的活性来或则阻断酪氨酸的氧化途径来实现美白的效果[3-4],据其抑制黑色素形成过中所起的作用不同,酪氨酸酶抑制剂可分为含酚羟基的化合物、黄酮类化合物、醛类化合物、羧基化合物和肽、氨基酸及其衍生物等[5]。已有研究表明,在海洋生物体内获得的胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用[6]。关于陆生动物胶原多肽抑制酪氨酸酶的报道尚属鲜见。

本文以从鸡爪皮中提取的分子量低于3 kDa的胶原多肽为实验对象,探索其对蘑菇酪氨酸酶活性抑制的机制,目的是希望获得酪氨酸酶抑制活性较高的肽类物质,并采用B16黑色素瘤细胞对其安全性和色素合成阻断功能进行研究,以期为大宗禽类副产品的利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验室制备的分子质量低于3 kDa的脱盐鸡爪皮胶原多肽;小鼠B16黑色素瘤细胞,中科院上海细胞保藏中心;L-多巴,阿拉丁试剂公司;蘑菇酪氨酸酶,Sigma公司;RPMI-1640培养基、小牛血清、胰蛋白酶、MTT购自 Gibco公司;二甲基亚砜(DMSO)、Triton-100等均购自于上海生物工程有限公司;其他试剂均为分析纯。

Tecan-M200酶标仪,瑞士Tecan;DK-80多温控精宏水浴锅,上海精宏;pHSJ-35 pH计,上海雷磁仪器厂;BPN-BOCH CO2培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;TS100倒置相差显微镜,日本尼康公司;超净工作台,苏净集团安泰公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蘑菇酪氨酸酶抑制效果测定方法

蘑菇酪氨酸酶酶活性测定方法是根据Hyung-Kyoon Choi[7]的方法进行适当调整而来的,采用200 μL的反应体系,按照表1加入药品进行反映,其中磷酸盐缓冲液、样品及蘑菇酪氨酸酶加入后于25℃水浴锅中保温10 min,再加入底物,于25℃水浴锅中反应10 min,测定475 nm波长的OD值。

根据测得的OD值计算蘑菇酪氨酸酶相对活性抑制率,蘑菇酪氨酸酶抑制率计算:

式中,I:蘑菇酪氨酸酶抑制率;A0:对照组空白测得的OD值;A1:对照组测得OD值;B0:样品组空白测得OD值;B1:样品组测得OD值。

表1 反应液组成及体积Table 1 Compositions and volume of reaction buffer

1.2.2 蘑菇酪氨酸酶半抑制浓度(IC50)的测定

以磷酸盐缓冲液将样品配制成不同浓度的溶液,使得在200 μL的反应体系中获得不同的抑制量。根据1.2.1的方法固定底物L-DOPA和酶的浓度,反应后测定各个单位OD值,带入公式(2),计算蘑菇酪氨酸酶活性率,绘制出剂量响应曲线。根据剂量响应曲线得出样品的IC50值,并进行验证实验。

式中,I:蘑菇酪氨酸酶活性率;A0:对照组空白测得的OD值;A1:对照组测得OD值;B0:样品组空白测得OD值;B1:样品组测得OD值。

1.2.3 鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力学测试

研究鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力学,可根据Lineweaver-Burk曲线来判定。固定反应体系中酶的浓度(25 U/mL),加入不同浓度的鸡爪皮胶原多肽,改变反应体系中底物浓度,测出每一组的反应初速度以OD475nm/min表示。以反应初速度的倒数和底物浓度的倒数分别为纵坐标和横坐标绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线,通过曲线交点所在象限判断鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶的竞争机制。

1.2.4 MTT法细胞增殖活性

取对数生长期的B16黑色素瘤细胞,胰蛋白酶消化后,使用RPMI-1640完全培养基配制成细胞密度为5×104的细胞悬浮液接种于96孔板,每孔200 μL,置于5%CO2、37℃培养箱中培养。贴壁24 h后,弃去培养基。向96孔板中加入200 μL含鸡爪皮胶原多肽(浓度为 0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL)完全培养基;对照组加入等体积的完全培养基。每一个样品浓度设置6个复孔,两个板分别培养24 h和48 h。用酶标仪于570 nm测定每孔细胞的OD值A。以A表示细胞增殖活性。

1.2.5 黑色素含量的测定

调整细胞浓度为5×105个/mL,接种于6孔板,每孔接种2 mL细胞悬浮液。贴壁后的细胞处理及培养条件同1.2.4,鸡爪皮胶原多肽浓度为0、25、50、100、200 μg/mL。每个浓度设置6个复孔,培养48 h后收获细胞,并计数细胞后定量。本研究参照Hideya Ando等[8]的方法稍作修改,加入10%DMSO的1 mol/L的NaOH溶液完全溶解裂解细胞,超声破碎处理30 min,80℃水浴加热2 h,于470 nm处测定OD值A,黑色素相对含量计算:

式中,I:黑色素相对含量,%;A1:样品组的 OD值;A0:空白组的OD值。

1.2.6 酪氨酸酶相对活性测定

细胞的接种密度、处理、培养条件及收获、计数方法同1.2.4。采用Kim[9]的方法于475 nm处测定0 min和30 min的OD值,计算蘑菇酪氨酸酶的相对活性:

式中,R:蘑菇酪氨酸酶相对活性,%;A30:样品组在30 min时测得OD值;A0:样品组在0 min时测得OD值;B30:空白组在30 min时测得OD值;B0:空白组在0 min时测得OD值。

1.2.7 数据处理方法

实验数据均是经过3次平行实验的得到的平均值,并采用SPSS19.0分析计算其标准偏差,Microsoft Excel(office 2003)软件作图。

2 结果与讨论

2.1 鸡爪皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的IC50测定结果与分析

鸡爪皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的剂量响应曲线是随着胶原多肽的浓度增加,蘑菇酪氨酸酶活变化的曲线。根据实验1.2.2的方法作图1,随着胶原多肽的浓度增加,蘑菇酪氨酸酶活性逐渐降低,说明胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶是具有抑制效果的。根据曲线拟合方程测得鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶的IC50值为0.426 mg/mL。与熊果苷[10]对蘑菇酪氨酸酶抑制的IC50=1.44 mg/mL相比,鸡爪皮胶原多肽的抑制蘑菇酪氨酸酶效果更好。这是由于熊果苷主要作用于酪氨酸→多巴这一反应过程,而对多巴→多巴醌这一过程的抑制效果较差。而鸡爪皮胶原多肽对多巴→多巴醌这一催化过程抑制效果较好。

图1 鸡爪皮胶原多肽的剂量对蘑菇酪氨酸酶活的影响(n=3)Fig.1 Effects of concentration of chicken collagen peptides on activity of tyrosinase(n=3)

2.2 鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力学测试

图2为鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力学的双倒数作图,均得到一组横轴截距不变的直线,5条直线相较于X负半轴,Km值表现为交点的负倒数,且保持不变,这说明鸡爪皮胶原多肽不影响米氏常数(Km);最大反应速度表现为五条直线在Y轴的截距的倒数,随着浓度的增加,Vmax逐渐降低,胶原多肽与酶分子的结合与底物分子与酶的结合是独立的,并不影响底物和酶的结合,抑制剂可以同时与游离(E)和结合酶(ES)结合,且结合常数相同,增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。以直线斜率(Intercept)和多肽浓度做图(内插图a),拟合直线,得到直线斜率为胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶的抑制常数(Ki)为10.76 mg/mL。

2.3 鸡爪皮胶原多肽对B16黑色素瘤细胞增殖活性的影响

鸡爪皮胶原多肽在不同浓度和不同时间对B16黑色素瘤细胞增殖活性影响曲线见图3。分别于24和48 h采用MTT检测法测定细胞相对数量。由图3可知,24和48 h时胶原多肽在0~200 μL/mL质量浓度范围内对细胞增殖活性均无显著性影响(P<0.05),而熊果苷在48 h时对细胞增殖活性有一定的抑制作用(P<0.05),从另一个角度来讲,熊果苷对细胞有微弱的毒性作用。

图2 鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制类型及抑制常数的测定(n=3)Fig.2 Chicken collagen peptides on the tyrosinase enzyme inhibition diol type and determination of inhibition constants(n=3)

图3 不同浓度鸡爪皮胶原多肽和熊果苷作用24 h、48 h对黑色素瘤细胞增殖活性的影响(n=6)Fig.3 Different concentrations of chicken collagen peptides and arbutin role 24 h,48 h on melanoma cell proliferation activity(n=6)

2.4 鸡爪皮胶原多肽对B16黑色素瘤细胞黑色素含量的影响

不同浓度鸡爪皮胶原多肽对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响见图4。通过测定细胞中黑色素吸光值计算黑色素的相对含量。从图4看鸡爪皮胶原多肽在0 μg/mL和25 μg/mL时差异性不显著,而浓度升高至50 μg/mL时差异性显著,熊果苷作为阳性对照,对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响均显著。当浓度为200 μg/mL时,胶原多肽和熊果苷作用的黑色素瘤细胞黑色素相对含量分别为57.83%和31.53%。

图4 不同浓度鸡爪皮胶原多肽和熊果苷对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响(n=6)同一组分标记字母不同,表示差异显著(P<0.05)Fig.4 Effect of different concentrations of chicken collagen peptides and Arbutin melanin content of melanoma tumor cells(n=6)

2.5 鸡爪皮胶原多肽对B16黑色素瘤细胞蘑菇酪氨酸酶酶活的影响

图5 不同浓度鸡爪皮胶原多肽和熊果苷对B16黑色素瘤细胞蘑菇酪氨酸酶酶活的影响(n=6)同一组分标记字母不同,表示差异显著(P<0.05)Fig.5 palmatum influence of different concentrations of collagen peptides and arbutin B16 melanoma cells activity of tyrosinase(n=6)

鸡爪皮胶原多肽作用黑色素瘤细胞对蘑菇酪氨酸酶活性抑制曲线见图5。胶原多肽在浓度范围为0~200 μg/mL时对黑色素瘤细胞蘑菇酪氨酸酶活性影响显著(P <0.05),200 μg/mL时活性降低到70.63%,熊果苷作为对照,对蘑菇酪氨酸酶抑制效果显著(P<0.05),曲线在50 μg/mL之后下降速度加快,到200 μg/mL时,蘑菇酪氨酸酶活性降低到75.17%。鸡爪皮胶原多肽能够被细胞吸收有效抑制黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性。

3 结论

目前市场上流行很多黑色素合成抑制剂,如氢醌、曲酸、熊果苷等,均是通过干扰黑色素的形成及转移过程而达到降低黑色素含量的目的。熊果苷和曲酸常用于市场上出现的各种美白产品中,研究表明,熊果苷和氢醌使用过多会导致皮肤出现永久性不可逆白斑[5];而曲酸是有细胞毒性作用的,并会增加卵巢细胞染色体变异的概率。因此需要寻找安全可靠无毒副作用的酪氨酸酶抑制剂。关于海洋生物胶原多肽抑制黑色素合成的研究已有报道[6]。

本研究中,鸡爪皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶活性的IC50=0.570 mg/mL,与熊果苷对蘑菇酪氨酸酶抑制的 IC50=1.44 mg/mL相比,抑制能力更显著[11],胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶属于非竞争性抑制;以小鼠B16黑色素瘤细胞为模型体外验证鸡爪胶原多肽的安全性及对黑色素合成的阻断作用。实验结果表明鸡爪皮胶原多肽对细胞增殖活性无明显影响,200 μg/mL时黑色素相对合成水平降低了42.17%,蘑菇酪氨酸酶相对活性下降了29.37%。其抑制黑色素合成的能力是与多肽浓度成正相关的,这与王静凤[13]等人的研究结果相似。关于鸡爪皮胶原多肽抑制黑色素合成的具体机制有待进一步探索。

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