聚缬氨酸修饰电极伏安法测定曲酸*

马心英，陈美凤，李方珍

(菏泽学院化学化工系，山东菏泽，274015)

曲酸(kojic acid，麴酸)是大多数曲霉属和青霉属真菌产生的一种常见的弱酸性代谢产物，化学名称为 5-羟基-2-羟甲基-γ-吡喃酮［1-2］，存在于酱油、豆瓣酱、酒类等酿造产物中，有抗菌和多酚氧化酶抑制作用，近年来由于曲酸在食品、化妆品及药物中的广泛应用，其安全性成为人们关注的焦点。2005年，日本突然指出曲酸具有致癌性，并宣布禁止将曲酸作为食品添加剂使用［3］。尽管少量的曲酸不会对人体构成威胁［4］，但研究表明连续过度使用曲酸会致癌［5-7］，因此建立简单快速的曲酸测定方法非常有必要。目前，对曲酸的分析方法不多，已经报道的主要有分光光度法［8-9］、高效液相色谱法［3］、毛细管电泳法［10］。这几种方法的操作步骤复杂，检测时间长，检测费用高，对仪器要求高。采用电化学法检测曲酸［11-13］具有操作简单快速，选择性好，灵敏度高等优点，目前国内用电化学方法检测曲酸报道较少［14-15］，特别是化学修饰电极法。电极表面经过修饰后，具有某些新功能，有利于提高电极的灵敏度和选择性、改善电极的稳定性和重现性［16-19］。氨基酸由于其分子结构含有羧基和氨基，作为化学修饰电极材料具有很多独特的性质，我们曾经用聚缬氨酸修饰电极成功测定去甲肾上腺素［20］。

本实验用聚缬氨酸修饰电极测定曲酸，研究了曲酸在修饰电极上的电化学行为，并用于食品中曲酸含量的测定。本修饰电极制备简单，选择性好，响应快，稳定性好，有较高的灵敏度，有较好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

CHI660C电化学工作站，上海辰华仪器公司;PHS-3B型酸度计，上海精密科学仪器有限公司;KQ-100型超声波清洗器，昆山市超声波仪器厂;电化学实验用三电极系统，聚缬氨酸修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。

曲酸标准品(中国药品生物制品检定所)，用水配制成8.00×10-4mol/L溶液，避光保存;

缬氨酸(天津市光复精细化工研究所)，配制成2.50×10-3mol/L溶液;

Na2HPO4-C6H8O7·H2O，配制成 PBS缓冲溶液;HAc-NaAc配制成ABS缓冲溶液。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次石英重蒸水。

1.2 聚缬氨酸修饰电极的制备

将玻碳电极(Φ=3.8 mm)在湿润的金相砂纸(粒度为2000)上磨光，然后在湿润的 Al2O3(0.05 μm)上抛光成镜面，依次用 HNO3(1∶1，V/V)、无水乙醇、二次石英亚沸蒸馏水超声清洗(1 min/次)。在5.00×10-4mol/L缬氨酸pH 8.0 PBS中，以玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在-1.4～2.6 V电位范围内，以140 mV/s扫描速率循环扫描9周，取出用二次蒸馏水淋洗电极表面，即制得聚缬氨酸修饰电极。

1.3 实验方法

在pH5.4 ABS中，加入一定量曲酸，以聚缬氨酸修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在0.5～1.4 V电位范围内，以120 mV/s扫描速率进行循环扫描，记录峰电位和峰电流。每次扫描结束后，将电极置于空白底液中循环扫描至峰消失，用二次蒸馏水冲洗，滤纸吸干后，即可进行下一次测定。

2 结果与讨论

2.1 聚缬氨酸修饰电极电化学聚合条件

电化学聚合条件影响修饰电极的性能，测定不同的底物，聚缬氨酸修饰电极的聚合条件不同。对于曲酸的测定，讨论了制备聚缬氨酸修饰电极的聚合底液的pH、聚合高低电位、聚合周数及扫描速率。实验结果表明，在5.00×10-4mol/L缬氨酸pH8.0 PBS中，在-1.4～2.6 V电位范围内，以140 mV/s扫描速率循环扫描9周，所制备的修饰电极对曲酸的测定具有最大的电流响应，对曲酸的电化学氧化催化效果最好。图1为缬氨酸在最佳聚合条件聚合过程的循环伏安图。由图可见，在扫描2周之后，随扫描周数的增加，氧化峰电位正移，还原峰电位负移，而峰电流增加，但增加幅度减小，最后氧化峰和还原峰都达到了稳定。聚合完成后，可观察到玻碳电极表面有深蓝色膜存在，图2为聚缬氨酸修饰膜扫描电子显微镜图，表明缬氨酸在电极表面形成了多分子层修饰膜。

图1 缬氨酸在玻碳电极表面聚合过程的循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammograms for electropolymerization of valine on a GCE surface

2.2 曲酸在聚缬氨酸修饰电极上的电化学特性

图3为曲酸分别在玻碳电极(1)、聚缬氨酸修饰电极(2)上的循环伏安曲线，由图3可见:曲酸在裸玻碳电极上的氧化峰电流为:ipa1=4.45 μA，而在聚缬氨酸修饰电极上氧化峰电流为:ipa2=9.45 μA，与裸玻碳电极相比，曲酸在聚缬氨酸修饰电极上的氧化峰电流明显增大1倍多，说明聚缬氨酸修饰膜对曲酸电化学氧化具有良好的催化作用，有利于曲酸在电极上的电化学氧化。从循环伏安曲线上未观察到还原峰，说明曲酸在修饰电极上的电极反应不可逆。

图2 聚缬氨酸修饰膜的扫描电子显微镜图Fig.2 SEM image of the surface of the poly(valine)modified electrode

图3 曲酸在玻碳电极(1)和聚缬氨酸修饰电极(2)上的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of kojic acid(1.00×10-4mol/L)at(1)the bare electrode and(2)the a poly(valine)modified electrode in pH 5.0 HAc-NaAc

2.3 测定曲酸的最佳条件

2.3.1 测定底液pH的影响

研究了曲酸在 H2SO4、HNO3、NH3·H2O-NH4Cl、KH2PO-Na2HPO4，HAc-NaAc等介质中的伏安行为，结果表明，在HAc-NaAc缓冲介质中曲酸在修饰电极上的氧化峰电流最大，因此选择HAc-NaAc缓冲溶液作为测定底液。由于氧化过程涉及到质子的参与，因此测定底液pH对电极反应的影响较大。固定其他实验条件不变，只改变测定底液的pH进行实验，结果表明pH在3.8～5.4的范围内随底液pH的升高，曲酸在修饰电极上氧化峰电流逐渐增大，当pH等于5.4时，曲酸氧化峰电流达到最大值，随后降低(图4)，故本实验选pH为5.4的ABS为测定底液。实验结果还表明，曲酸氧化峰电位随着pH值的升高发生负移，在pH3.8～5.8之间，其线性回归方程为Epa=1.27-0.066pH，相关系数 r=0.992 5，斜率为0.066，接近0.059，说明曲酸在氧化过程中涉及质子的参与，且质子转移数等于电子转移数，其可能的电极反应式为［19］:

图4 2.00×10-4mol/L曲酸在聚缬氨酸修饰电极上的随pH变化的CV曲线Fig.4 Cyclic voltammograms of 2.00×10-4mol/L kojic acid at a poly(valine)modified electrode in HAc-NaAc of various pH

2.4.2 测定电位的影响

测定电位范围对曲酸在修饰电极上的氧化峰电流大小有一定影响。固定测定低电位为0.5 V及其他条件不变，只改变高电位进行实验，结果表明，当高电位为1.4 V时，曲酸在修饰电极上的响应电流最大;固定测定高电位为1.4 V及其他条件不变，当低电位为0.5 V时，曲酸在修饰电极上的响应电流最大，故本实验选择的测定电位范围为0.5～1.4 V。

2.4.3 扫描速度的影响

改变扫描速度进行实验，结果表明，氧化峰电流与扫描速度的大小呈线性关系(图5)，其线性回归方程为:ipa=9.66×10-8v+6.34×10-6，相关系数为:r=0.999 1;说明曲酸在修饰电极上的电极过程为吸附过程。随扫描速度的增加，峰电流增加(图5)在扫描速度为120 mV/s时，峰形最好，故本实验选用扫描速度为120 mV/s。

2.5 工作曲线和重现性

由于曲酸易于与一些金属离子配位，而且EDTA和Na2SO3溶液的加入对曲酸的电化学响应影响很小，因此在测定底液中加入0.3 mol/L EDTA作为金属离子的掩蔽剂，加入质量分数为1%的Na2SO3作为抗氧化剂，以防止Fe3+的干扰，并且实验采用加入EDTA和Na2SO3后的体系做工作曲线。在最佳实验条件下，用循环伏安法对不同浓度的曲酸标准溶液进行测定(循环伏安曲线如图6)。实验结果表明，曲酸标准溶液在浓度范围7.00×10-6～6.50×10-4mol/L内与氧化峰电流有良好的线性关系，其线性回归方程为ipa=3.89×10-6+0.048c，相关系数为 r=0.998 3，检出限为8.50×10-7mol/L。

图5 不同扫速下2.00×10-4mol/L的曲酸在聚缬氨酸修饰电极上的循环伏安图Fig.5 Cyclic voltammograms of 2.00×10-4mol/L kojic acid at a poly(valine)modified electrode

用聚缬氨酸修饰电极对2.00×10-5mol/L曲酸标准溶液进行测定5次，测得结果的RSD为1.4%，表明该电极对曲酸的测定有较好的重现性。

图6 不同浓度的曲酸在聚缬氨酸修饰电极上的循环伏安曲线Fig.6 Cyclic voltammograms of kojic acid at various concentrations at a poly(valine)modified electrode in pH 5.4 HAc-NaAc.Scan rate:120 mV/s

2.6 干扰实验

在上述实验条件下，以1.20×10-5mol/L的曲酸作干扰离子实验。实验结果表明，在允许相对误差在±5%范围内，100倍于曲酸量的K+、Ca2+、Mg2+、、柠檬酸根、蔗糖，10倍的抗坏血酸不干扰测定。

2.7 样品及回收率的测定

称取黄豆酱10.20 g，粉碎至糊状，加水30.00 mL稀释，搅匀，用真空抽滤泵进行抽滤得抽滤液，所得残渣洗涤2次，收集滤液转移至100 mL容量瓶，加入5 mL 0.3 mol/L EDTA溶液，掩蔽金属离子，加入5 mL质量分数为1.00%Na2SO3溶液，防止Fe3+干扰，用二次蒸馏水定容。取一定量配制好的黄豆酱稀释液，加入一定量pH5.4ABS缓冲溶液于电解池中，对其进行测定，并进行回收率实验，所得结果为电解池中曲酸浓度，见表1。计算得该黄豆酱中所含曲酸的质量分数为0.11%。

取25.00黄酒样品分别于100.00 mL容量瓶中，分别加入2.00 mL 0.03 mol/L EDTA溶液，2.00 mL 1.00%Na2SO3溶液，再用pH 5.4ABS缓冲溶液稀释至刻度，取一定量在最佳实验条件下测定并进行回收率实验，所得结果为电解池中曲酸浓度。计算得该黄酒中所含曲酸的含量为37.63 mg/kg，结果见表1。

表1 样品中曲酸的测定结果Table 1 Determination results of kojic acid in samples(n=6)

3 实验结论

利用电化学方法制备了聚缬氨酸修饰电极，聚合条件影响修饰电极的催化效果。在pH=5.4醋酸盐缓冲溶液中，聚缬氨酸修饰电极对曲酸电化学氧化具有良好催化作用，利用该修饰电极可准确地测定曲酸的含量。其线性范围为7.00×10-6～6.50×10-4mol/L，相关系数为r=0.998 3，检出限为8.50×10-7mol/L，回收率为96.0% ～99.0%之间，可用于黄豆酱及黄酒中曲酸含量的测定。

［1］ 陶文沂，孙微，徐正宏，等.曲酸在食品中的应用［J］.中国食品添加剂，2000，2:26-31.

［2］ 李学如，王艳，孟涛.食品中曲酸安全性评价研究进展［J］. 食品与发酵工业，2005，31(12):79-83.

［3］ 黄娟，刘艳，丁涛，等.高效液相色谱一串联质谱法测定食品中曲酸［J］. 色谱，2012，30(6):578-583.

［4］ Burdock G A，Soni M G，Carabin I G.Evaluation of health aspects of kojic acid in food ［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2001，33(1):80-101.

［5］ Chusiri Y，Wongpoomchai R，Kakehashi A，et al.Nongenotoxic mode of action and possible threshold for hepatocarcinogenicity of Kojic acid in F344 rats ［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49(2):471-476.

［6］ Fujimoto N，Watanabe H，Nakatani T，et al.Induction of thyroid tumours in(C57BL/6N x C3H/N)F1 mice by oral administration of kojic acid［J］.Food and Chemical Toxicology，1998，36(8):697-703.

［7］ Wei C I，Huang T S，Fernando S Y，et al.Chung Mutagenicity studies of kojic acid［J］.Toxicology Letters，1991，59(1-3):213-220.

［8］ Piantavini M S，Stremel D P，Trindade A C L B et al.Validation of a spectrophotometric method in the visible region for the quantification of kojic acid in raw materials and products［J］.Latin American Journal of Pharmacy，2010，29(8):1 468-1 472.

［9］ Januario Correr C，Cordeiro G，Gasparetto J，et al.Determinacdeãcido kójico em produtos farmacêuticos por espectroscopia UV-vis e processo de calibracão multivariada［J］.Acta Farm.Bonaerense，2005，24(3):416-420.

［10］ Lin Y H，Yang Y H，Wu S M.Experimental design and capillary electrophoresis for simultaneous analysis of arbutin，kojic acid and hydroquinone in cosmetics［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44(1):279-282.

［11］ Liu J，Zhou D，Liu X，et al.Determination of kojic acid based on the interface enhancement effects of carbon nanotube/alizarin red S modified electrode ［J］.Colloids and Surfaces B，2009，70(1):20-24.

［12］ Wang Y，Zhang D，Wu J.Electrocatalytic oxidation of kojic acid at a reduced graphene sheet modified glassy carbon electrode［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，2012，664(1):111-116.

［13］ Yang Z，Yin Z，Chen F.A novel kojic acid amperometric sensor based on hollow CuO/Fe2O3hybrid microspheres immobilized in chitosan matrix ［J］.Electrochimica Acta 2011，56(3):1 089-1 093.

［14］ 周君，狄俊伟.曲酸的电化学行为及其应用［J］.南通职业大学学报，2005，19(4):8-9.

［15］ 周君，狄俊伟，屠一锋.基于硅溶胶一凝胶化学修饰电极直接测定酱油中的曲酸［J］.食品科技，2007(6):214-215.

［16］ 贾莉，雷秋芬，张修华，等.邻氨基硫酚自组装膜修饰电极测定多巴胺［J］.应用化学，2005，22(2):172-175.

［17］ 孙登明，马伟，吴云.聚L-异白氨酸修饰电极的制备及对多巴胺的测定［J］.应用化学，2006，23(11):1 214-1 217.

［18］ 韩晓霞，高作宁.DA和AA在CPB现场修饰碳糊电极上的电化学行为及电分析方法［J］.应用化学，2007，24(7):770-773.

［19］ 陈高礼，马伟，孙登明.银掺杂聚L-天冬氨酸修饰电极的制备及对肾上腺素的测定［J］.应用化学，2010，27(3):353-357.

［20］ 马心英，林宪杰.聚缬氨酸修饰电极在抗坏血酸共存下选择性测定去甲肾上腺素［J］.应用化学，2009，26(3):287-291.