抗寒类蛋白与冷驯化诱发昆虫耐寒的生理调节研究

唐 斌，林青青，邬梦静，施兴荣，王世贵

(杭州师范大学动物适应与进化重点实验室，杭州 310036)

昆虫属于变温动物，体温随着环境温度的改变而改变。尤其是冬季的寒冷气候条件对昆虫的生长发育和存活有较大影响，低温不仅使其活动减缓，易被天敌捕食，同时也易造成其冻伤或死亡(郑霞林，2012)。自然界中，不同气候地区的昆虫每年都遭受着长期或短期对生命活动不同程度的冬季低温伤害。低温对包括昆虫在内的所有生物的伤害可分为冷害和冻害(Cristina et al.，2011)。为了能够安全越冬，昆虫进化形成了一系列适应低温的策略，主要依靠提高昆虫自身的抗寒能力来实现。

1 昆虫的耐寒性

昆虫的耐寒性指昆虫长期或短期暴露于低温条件下的存活能力(Lee，1989)，昆虫耐寒能力强弱决定其种群的发生、扩散和分布，严格限制着昆虫种群的延续(景晓红和康乐，2002)。昆虫耐寒性的强弱不仅与自身固有的遗传性状有关，还受外界环境因子的显著影响，如地理纬度(Hoffmann，2007)、食物(景晓红和康乐，2002)、光周期(时爱菊，2007)、季节性气候(马延龙等，2009)、低温驯化和降温速率(Colinet et al.，2006)等，具有较大幅度的可塑性。这为研究天敌昆虫的长期低温保存技术提供有利的支撑。

1.1 过冷却点

1901年Bachmejew 在一次实验中偶然间发现:当昆虫的体液低于冰点温度时，虫体仍能保持液体状态的现象，并确定其为昆虫的过冷却现象(Super-cooled phenomenon)。其后通过对890 多种昆虫的进一步实验，证实了昆虫确实存在过冷却现象这一特性(戈峰，2008)，科学家将能使昆虫体液保持液态的最低温度称为昆虫的过冷却点(super-cooling point，SCP)(Morey et al.，2012)。直至今日，过冷却点的高低仍作为昆虫耐寒性的主要指标之一(张飞萍等，2009)。越冬昆虫一般都有较低的过冷却点，例如美国白蛾Hyphantriacunea 的SCP 为-11.9℃(孔锋等，2007)，中华通草蛉Chrysoperla sinica 成虫的SCP约为-13℃(郭海波等，2006)，寄生在黑松上的雌松突圆蚧Hemiberlesia pitysophila Takagi 的SCP 约为-12.91℃(钟景辉，2009)，25℃时异色瓢虫Harmonia axyridis 成虫的SCP 主要集中在-10℃至-9℃范围内(赵静，2011)。

1.2 耐寒与抗寒策略

昆虫在长期进化中形成两种主要的低温适应性对策:一是行为对策，即通过某些行为活动寻找躲避场所，如通过远距离的迁飞、休眠、滞育等躲避低温等;二是生理策略，即通过改变生理状态来提高昆虫的抗寒性，如储存更多的抗寒物质(秦资，2012)。不同种类的昆虫有着不同的策略，且同种昆虫的不同发育阶段、不同个体间的抗寒性也有很大差异(陈豪等，2010)。根据昆虫抗寒能力的生理生化机制，可以将昆虫分为耐寒昆虫(freeze-susceptibles)和耐冻昆虫(freeze-tolerants)(景晓红和康乐，2002;Morey et al.，2012)，绝大多数昆虫为耐寒昆虫(Jacques and Barbara，2007)。

耐寒昆虫指可忍耐0℃以上低温伤害的昆虫，其通过维持虫体的过冷却状态，阻止体内液体结冰使之免受冻害(梅增霞和李建庆，2006)。为了避免体液结冰，昆虫在越冬前把冰核物质排出体外或使之失去活性，以降低过冷却点，减少越冬死亡率(崔双双和贺一原，2011)。其次，通过排除水分以增加体内溶质的浓度，降低了体液的冰点和过冷却点。接着，昆虫通过提高两类抗寒性物质的合成，即小分子的物质和抗冻类蛋白(antifreeze proteins，AFPs)(Zachariassen and Husby，1982;王鹏等，2011)，进一步提高抗过寒能力。

2 抗寒类蛋白

2.1 抗冻蛋白

某些低温生物为适应极端寒冷环境产生了一类抑制冰晶生长的蛋白质，它能以非依数性形式降低溶液的冰点(Holden and Storey，1994)。1969年，斯坦福大学的Devries 在南极Mcmurdo 海峡捕获的一种名为Nototheneniid 的鱼的血液中首次发现此种蛋白，并命名为抗冻蛋白，其也常定义为具有热滞活性的冰结合蛋白(高媛和田淑琴，2010)。研究发现昆虫抗冻蛋白可以把血淋巴的冰点降低5℃甚至更多，而一般鱼类抗冻蛋白只能把体液冰点降低1.5℃(毛新芳和张富春，2009)。因此，昆虫体内AFPs 的抗冻活性比鱼类AFPs 的抗冻活性要高许多，且其最大活性能够达到鱼类抗冻蛋白最大活性的3-4 倍(Yue and Zhang，2009)，此外昆虫和鱼类的抗冻蛋白的分子结构也有所不同，这可能与冬季陆地的温度更低有关(田云等，2002)。

2.1.1 昆虫抗冻蛋白的类型及结构特性

相关研究结果发现:低温下抗冻蛋白能够长时间的维持昆虫亚稳定的过冷却状态(马纪和赵干，2006)。昆虫的体液以及肠液和细胞内液中都能分泌并合成抗冻蛋白(陈豪等，2010)。到目前为止，昆虫科学研究工作者在昆虫体内已经提取出二十多种不同抗冻蛋白，这些昆虫包括鞘翅目、长翅目、半翅目、直翅目、弹尾目等(彭淑红等，2003)，其中鞘翅目抗冻蛋白的研究比较深入，几种主要昆虫抗冻蛋白基因及其编码蛋白的特性见表1。昆虫AFPs 的分子量一般约为8 kd-9 kd，无糖基化位点并且含有较多的亲水性氨基酸，有40%-50%的氨基酸残基能形成氢键(刘忠渊等，2004)。

表1 几种主要昆虫抗冻蛋白基因及其编码蛋白的特性Table 1 Characteristics of some insect antifreeze protein genes and their coding proteins

2.1.2 抗冻蛋白的特性及作用机制

抗冻蛋白的常定义为:一类具有热滞活性的冰结合蛋白(毛兴芳，2011)，因此，抗冻蛋白亦称为热滞蛋白(Thermal Hysteresis Proteins，THPs)(GrahamL et al.，1997)。抗冻蛋白具有几种特殊的性质，使之具有不同于其他蛋白的“抗冻”活性，其抗冻活性的高低与本身的性质有关而与数量无关(Koštál et al.，2011)。学者们常以热滞活性作为衡量抗冻蛋白活性的指标，热滞活性是指昆虫体液冰点和熔点的差值，差值越大抗冻活性越大(孙琳杰，2008)。抗冻蛋白同时还具有2个保护有机体免受结冰伤害的主要特征:热滞效应(Thermal Hysteresis Activity，THA)、重结晶抑制效应(Recrystalization Inhabition)(高媛和田淑琴，2010)。以非依数性形式只降低水溶液的冰点但不影响其熔点的热滞效应是抗冻蛋白的一个重要特征(毛新芳和张富春，2009)。

昆虫的抗冻蛋白主要通过重结晶抑制效应来降低生物有机体因体内结冰引起的伤害(马纪和赵干，2006)。抗冻蛋白可以特异的、不可逆地与冰晶结合(Kostal et al.，2004)抑制冰晶生长外，同时还可改变冰晶形态、降低过冷却点、抑制成冰核蛋白的作用和降低玻璃化与去玻璃化损伤(Pertaya et al.，2007)。相关研究还表明抗冻蛋白的产生还具有明显的季节性(Barrett，2001;赵静等，2010)。

2.2 热激蛋白

热激蛋白(heat-shock proteins，HSPs)，又称为热休克蛋白，首先是在果蝇 Drosophila melanogaster 体内发现的(Ritossa，1964)。热激蛋白是一种抗逆蛋白，在细胞受到胁迫时表达量会增加，对细胞起到一种保护作用，帮助生物机体度过不利环境条件(Craig et al.，1983)。1974年，Tissieres 进一步通过实验分离得到了在热激下产生的这种特殊蛋白，该反应称之为热激反应(heat shock response)(Tissieres et al.，1974)。随后的研究发现，热激蛋白普遍存在大部分的生物体中，为生物体在高温或者其他环境的胁迫下所产生的一种特定的应激性的蛋白，是一种进化上高度保守的蛋白(景晓红和康乐，2002)。热激蛋白由热休克基因转录翻译后产生，热休克基因是编码诱导型HSPs 的基因，而编码组成型表达的热休克相关蛋白的基因称为热休克相关基因(heat shock cognate genes)(Tissieres et al.，1974)。

图1 赤拟谷盗热激蛋白的聚类分析Fig.1 Phylogenetic analysis of heat shock proteins in Tribolium castaneum

图2 黑腹果蝇、意大利蜜蜂、甜菜夜蛾、东亚飞蝗热激蛋白的聚类分析Fig.2 Phylogenetic analysis of heat shock proteins in Drosophila melanogaster，Apis mellifera，Spodoptera exigua and Locusta migratoria

2.2.1 热激蛋白的类型

热激蛋白广泛存在于微生物和动植物体内，是一个蛋白质超家族，按照其相对分子量、结构和功能，可以分为以下几大类:HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSPl00 和低分子量家族(陈莉，2012)。许多昆虫的热激蛋白被研究和报道，赤拟谷盗基因组序列中发现25个HSP 编码蛋白(图1)(Mahroof et al.，2007)，其它昆虫中同样也有众多多个HSP 被克隆和研究报道(图2)(Hoskins et al.，2002;Kaminker et al.，2002;Misra et al.，2002;Celniker et al.，2002;Quesneville et al.，2005;Wang and Kang，2005;Wang et al.，2006;Smith et al.，2007;Wang et al.，2007;Hoskins et al.，2007;Xu et al.，2011)。

2.2.2 热激蛋白的性质及作用机制

在冷、热胁迫下，机体内最明显的生理变化之一是热休克蛋白的表达量升高(陈亮，2007)。热激蛋白具有普遍性，所有的原核、真核生物都具有热激蛋白。热激蛋白具有进化上的保守性和范围上的广泛性，说明热激蛋白在生物体内具有重要的生理意义(陈亚琼等，2006)。热激蛋白是一类重要的分子伴侣，它参与蛋白的折叠、蛋白的降解以及细胞内物质的运输等过程，调节靶细胞的活性，但是不参与靶蛋白的合成(黄惠芳和马飞，2004)。在机体受到刺激时，细胞发生损害，产生变性蛋白，表现为肽链失去盘旋和折叠，失去原本的空间结构，使得蛋白活性功能丧失。而这时产生的热激蛋白可以促进肽链重新进行折叠，修复错误折叠的蛋白，恢复原有的空间结构和生物活性，提高其耐受性(Beekmann et al.，1990;Moseley et al.，1997)。

热激蛋白受多种外界条件的影响，外界不良环境易诱导昆虫体内热激蛋白的产生。例如，冷休克处理能诱导美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard 体内热休克蛋白基因HSP90、HSP70、HSP40 和一些小分子HSPs 的表达(Huang and Kang，2007)。热激蛋白具有多样性、同源性。热激蛋白的种类多样，分子量从15 kD-110 kD 或更高，定位于多种细胞器(王建义和慈忠玲，2008)。不同物种有同源性很高的热激蛋白，如酵母菌Saccharomyces cerevisiae 与果蝇的HSP70 在氨基酸序列中有72%相同，两者的HSP84 氨基酸序列有63%同源(Kanteng and Phlla，1991)。

3 低温驯化对昆虫抗寒性的调节

在自然界中，昆虫越冬前都是经历一个温度渐变的过程(即气候驯化)，使它们得以为渡过低温环境作一些生理上的准备(Leather et al.，1993)，作出相应的抗寒对策，如提高抗寒基因的表达等。冷驯化(cold-acclimation)是将昆虫暴露于亚致死低温一段时间可有效地提高其在致死低温下存活率的过程和现象，适当的冷驯化可以提高昆虫的抗寒能力。自然界中，针对不同的低温栖境，昆虫会采取不同的抗寒策略。对于所有昆虫来说，这种能够增强低温抵抗能力的机制可以通过低温诱导不同时间来触发。增强昆虫耐寒性的2种主要驯化策略有快速冷驯化和长时冷驯化(Rajamohan and Sinclair，2008)。

适度的低温冷驯化可以提高昆虫成虫的低温抵抗力，但是冷驯化在诱导昆虫耐寒能力增加的同时不可避免地对生长发育或者适合度的其他方面产生影响(郭海波等，2006)。例如，异色瓢虫亲代经历冷驯化后，后代生命表参数内禀增长率、周限增长率、净生殖力和年龄特征存活率均降低，而后代雌虫所占比例却升高(赵静等，2010)。

3.1 快速冷驯化

快速冷驯化(rapid cold hardening，RCH)是指在短时间内用较低的温度提高昆虫的耐寒性，增强它们的耐寒能力，降低昆虫的过冷却点。快速冷驯化是一个较为简单、耗时较短的冷驯化方式，是昆虫应对自然界温度急剧变化和短期低温暴露的一种有效策略(岳雷等，2013)。昆虫快速冷驯化能够提高昆虫耐寒性，例如，蝇在冷暴露于-5℃之前经RCH(以0.1℃/min 从25℃降温至0℃，并在0℃保持1 h)处理72 h 的死亡率为37%，显著低于直接进行冷休克处理的60%(Overgaard et al.，2007)。

RCH 可以抑制昆虫体内物质的产生避免细胞甚至虫体死亡。Yi 和Lee(2011)的深入研究表明，RCH 通过抑制红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis半胱氨酸酶前体的活化来避免冷休克诱导的细胞程序性死亡，从而降低组织细胞的死亡率。快速冷驯化可以诱导机体内抗冻蛋白、热激蛋白及抗寒性小分子基因的快速表达，有利于提高机体内抗寒物质的增加(马延龙等，2009)。例如，在冷驯化期间，美洲斑潜蝇Liriomyza sativae 体内小分子热休克蛋白基因HSP19.5、HSP20.8 和HSP21.7被显著诱导产生热休克蛋白，其中以HSP20.8 对冷驯化最为敏感，且不同强度冷胁迫条件下其表达的热休克蛋白种类和含量不同(Huang et al.，2009)。

3.2 长时冷驯化

长时冷驯化(cold acclimation，ACC)通常需要较长时间(几天，几周甚至几个月)完成，可显著延长昆虫在亚致死低温下的存活时间，处理温度相对温和，通常由季节信号(如光周期缩短、环境温度降低)诱导产生(Kostál et al.，2004)。长时冷驯化的条件很温和，温度降低缓慢，处理时间较长，可以使昆虫一直保持在一个较适宜的机体平衡下，死亡率也较低(Koštál et al.，2011)。例如德国小蠊以0.1℃/min 的较慢速率降温比1.0℃/min 的较快速率降温存活率高2 倍多(刘峰和赖世宏，2004)。

长时冷驯化同时也与昆虫的越冬息息相关。例如，桃小食心虫Carposina niponensis 越冬幼虫体内总脂肪、总蛋白、糖原和水的含量变化与幼虫SCP 的变化趋势具有一定的相似性，说明3种生化物质的总含量和含水量与SCP 间存在明显的内在联系(王鹏等，2011)。长时冷驯化处理后，昆虫体内AFP 基因表达水平在处理的第5 天与对照组相比差异显著(Kostál，2004)。长时冷驯化通常引起昆虫细胞膜蛋白、酶活性及体内代谢谱的改变(赵静等，2010)。Shintani 和Ishikawa 对黄星天牛Psacothea hilaris 卵的耐寒性研究表明，经ACC(15.5℃保持9 d)处理再暴露于0℃至-22℃的低温时，卵存活率显著高于未经ACC 处理的对照(25℃保持5 d 后进行低温暴露);在冷胁迫(-10℃暴露8 h 以上)条件下经ACC 处理的卵的存活率显著高于经RCH(0℃暴露4 h)处理的卵;相反，在卵的过冷却点-26℃左右，ACC处理和对照的存活率均很低，RCH 处理的存活率则较高(Shintani and Ishikawa，2007)。

4 结论与展望

当昆虫面对寒冷环境时，会启动一系列抗寒机制来保护自身的安全，如通过调控体内相关抗寒基因大量表达，一方面大量合成抗逆物质等，另一方面增加细胞内的抗冻蛋白、热激蛋白等抗冻类蛋白的含量。昆虫机体能够在经历一次次的冷环境驯化后，抗寒能力大大增强。

昆虫耐寒性研究是昆虫生态学和生物进化研究的热点领域，也是害虫预测预报和防治的理论基础。首先，通过体外高效表达AFPs 等抗寒类蛋白的研究，可将其用在食品冷冻贮藏中，从而保持食品质量和口感(Warren and Mueller，1992);另一方面，抗冻蛋白和抗逆物质的研究可能对器官移植、低温水域水产养殖等方面有所帮助。更为重要的是，在植物害虫生物防治领域，通过对昆虫耐寒性、抗寒基因调控的研究，了解昆虫的抗寒机制，探索适宜的冷驯化处理条件，来提高天敌昆虫的储存时间，并保证其捕食效果，为天敌昆虫的长期低温保存和筛选高抗逆品系提供理论依据，以解决天敌昆虫的“货架期短”和“低抗逆”等潜在问题，从而培育出“高抗逆”和“货架期长”的天敌昆虫种类或者品系，大大促进和推动我国“以虫治虫”的生物防治事业发展。赤眼蜂是我国目前人工繁殖量最大和应用范围最广的寄生性天敌，作为天敌昆虫，防治效果好，防治成本低，若可以更长时间的储存赤眼蜂，不但能够降低害虫控制的成本，还可以保护自然界的生态和谐，并为我国的绿色和有机食品安全生产保驾护航。因此，以部分昆虫为研究对象，先充分研究其耐寒性，分析其抗寒的分子机理，这对于其他昆虫物种尤其是天敌昆虫的低温储存具有重要的理论意义。这些研究也是提高生物防治在害虫防治中比例的基础，将大大推动和促进我国害虫生物防治事业的发展。

References)

Barrett J.Thermal hysteresis proteins［J］.Int.J.Biochem.Cell.Biol.，2001，33(2):105-117.

Celniker SE，Wheeler DA，KronmillerB，et al.Finishing a whole-genome shotgun:release 3 of the Drosophila melanogaster euchromatic genome sequence［J］.Genome Biol.，2002，3(12):RESEARCH0079.

Chen H，Liang GM，Zou LY，et al.Research progresses in the cold hardiness of insects［J］.Plant Protection，2010，36(2):18-24.［陈豪，梁革梅，邹朗云，等.昆虫抗寒性的研究进展［J］.植物保护，2010，36(2):18-24］

Chen L.Cloning and Expression Analysis of HSP90 Gene from the Chinese Oak Silkworm，Antheraea pemyi［D］.Anhui:Anhui Agricultural University，2012.［陈莉.柞蚕热激蛋白90 基因的克隆与表达分析［D］.安徽:安徽农业大学，2012］

Chen L.Expression Analysis of Heat Shock Protein 70 Gene and Antifreeze Protein Gene from Anatolica polita borealis［D］.Xinjiang:Xinjiang University，2007.［陈亮.光滑鳖甲热休克蛋白70 基因及抗冻蛋白基因表达规律的初步研究［D］.新疆:新疆大学，2007］

Chen YJ，Sun XG，Zhang WG，et al.Relationship between variation of protein，amino acid，low-molecular carbohydrate in over-wintering Diaphania pyloalis Walker larvae and cold-hardiness［J］.Science of Sericulture，2005，31(2):111-115.［陈永杰，孙绪艮，张卫光，等.桑螟越冬幼虫体内蛋白质、氨基酸、碳水化合物的变化与抗寒性的关系［J］.蚕业科学，2005，31(2):111-115］

Chen YQ，Xiao TH，Zhou ZK.The relationship between heat shock proteins and biological adaptation and evolution［J］.Progress in Natural Science，2006，16(9):1066-1073.［陈亚琼，肖调红，周浙昆.热激蛋白与生物环境适应及进化的关系［J］.自然科学进展，2006，16(9):1066-1073］

Colinet H，Renault D，Hance T，et al.The impact of fluctuating thermal regimes on the survival of a cold-exposed parasitic wasp，Aphidius colemani［J］.Physiological Entomology，2006，31(3):234-240.

Cui SS，He YY.Insect cold hardiness and the influencing factors［J］.Life Science Research，2011，15(3):273-276.［崔双双，贺一原.昆虫的耐寒性及其影响因素［J］.生命科学研究，2011，15(3):273-276］

Devries AL，Wohlschlog DE.Freezing resistance in some antartic fishes［J］.Science，1969，163(3871):1073-1075.

Gao Y，Tian SQ.The research progress and challenges of antifreeze proteins［J］.Research and Application of Veterinary Drug，2010，10:45-46.［高媛，田淑琴.抗冻蛋白新近研究进展及面临的挑战［J］.兽药研究与应用，2010，10:45-46］

Ge F.Principle and Methods of Insect Ecology［M］.Beijing:Higher Education Press，2008，158-162.［戈峰.昆虫生态学原理与方法［M］.北京:高等教育出版社，2008，158-162］

Graham LA，Liou YC，Walker VK，et al.Hyperactive antifreeze protein from beetles［J］.Nature，1997，388(6644):727-728.

Guo HB，Xu YY，Ju Z，et al.Seasonal changes of cold hardiness of the green lacewing，Chrysoperla sinica(Tjeder)(Neuroptera:Chrysopidae)［J］.Acta Ecologica Sinica，2006，26(10):3238-3244.［郭海波，许永玉，鞠珍，等.中华通草蛉成虫抗寒能力季节性变化［J］.生态学报，2006，26(10):3238-3244］

Hoffmann AA，Hallas R，Sinclair C，et al.Levels of variation in stress resistance in drosophila among strains，local populations，and geographic regions:patterns for desiccation，starvation，cold resistance，and associated traits［J］.Evolution，2007，55(8):1621-1630.

Holden CP，Storey KB.6-phosphogluconate dehydrogenase from a freeze tolerant insect:control of the hexose monophosphate shunt and NADPH production during cryoprotectant synthesis［J］.Insect Biochemical Biol.，1994，24(2):167-173.

Hoskins RA，Carlson JW，Kennedy C，et al.Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin［J］.Science，2007，316(5831):1625-1628.

Hoskins RA，Smith CD，Carlson JW，et al.Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly［J］.Genome Biol.，2002，3(12):research0085.1-85.16.

Huang HF，Ma F.The molecular evolution of heat shock protein［J］.Journal of Xiamen Univesity(Natural Science)，2004，43:166-170.［黄惠芳，马飞.热激蛋白的分子进化研究［J］.厦门大学学报(自然科学版)，2004，43:166-170］

Huang LH，Kang L.Cloning and interspecific altered expression of heat shock protein genes in two leafminer species in response to thermal stress［J］.Insect Mol.Biol.，2007，16(4):491-500.

Huang LH，Wang CZ，Kang L.Cloning and expression of five heat shock protein genes in relation to cold hardening and development in the leafminer，Liriomyza sativae［J］.J.Insect Physiol.，2009，55(3):279-285.

Jacques R，Barbara B.Modeling cold tolerance in the mountain pine beetle，Dendroctonus ponderosae［J］.Journal of Insect Physiology，2007，53(6):559-572.

Jing XH，Kang L.Research progress in insect cold hardines［J］.Acta Ecologica Sinica，2002，22(12):2202-2207.［景晓红，康乐.昆虫耐寒性研究.生态学报，2002，22(12):2202-2207］

Kaminker JS，Bergman CM，Kronmiller B，et al.The transposable elements of the Drosophila melanogaster euchromatin:a genomics perspective［J］.Genome Biol.，2002，3(12):RESEARCH0084.

Kanteng WS，Phlla BA.Flavonoid，but not protein kinase C inhibitors，prevents stress protein synthesis during erythrophagocytosis［J］.Biochem.Biophys.Res.Commun.，1991，180:308-314.

Keeling CI，Henderson H，Li M，et al.Transcriptome and full-length cDNA resources for the mountain pine beetle，Dendroctonus ponderosae Hopkins，a major insect pest of pine forests［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2012，42(8):525-536.

Kong F，Han RD，Pei YH，et al.Cold hardiness of the overwintering pupae of fall webworm Hyphantria cunea(Drury)(Lepidoptera:Arctiidae)［J］.Science of Sericulture，2007，33(4):534-537.［孔锋，韩瑞东，裴元慧，李红梅，等.美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)越冬蛹的抗寒性研究［J］.蚕业科学，2007，33(4):534-537］

Koštál V，Korbelová J，Jan Rozsypal，et al.Long-term cold acclimation extends survival time at 0℃ and modifies the metabolomicprofiles of the larvae of the fruit fly Drosophila melanogaster［J］.PLoS ONE，2011，6(9):e25025.

Kostál V，Vambera J，Bastl J.On the nature of prefreeze mortality in insects:water balance，ion homeostasis and energy charge in the adults of Pyrrhocoris apterus［J］.J.Exp.Biol.，2004，207:1509-1521.

Kristiansen E，Ramlov H，Hojrup P，et al.Structural characteristics of a novel antifreeze protein from the longhorn beetle Rhagium inquisitor［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2011，41(2):109-117.

Leather SR，Walters KFA，Bale JS.The Ecology of Insect Overwintering［M］.Cambridge:Cambridge University Press，1993.

Lee RE.Insect cold hardiness:to freeze or not to freeze［J］.Bioscience，1989，39(2):308-313.

Liu F，Lai SH.Study on cold resistance of Blattella germanica method［J］.Journal of Medical Pest Control，2004，20(7):396-397.［刘峰，赖世宏.德国小蠊耐寒性研究方法的探讨［J］.医学动物防制，2004，20(7):396-397］

Liu ZD，Gong PY，Wu KJ，et al.Effects of larval host plants on overwintering preparedness and survival of the cotton bollworm，Helicoverpa armigera(Hübner)(Lepidoptera:Noctuidae)［J］.Journal of Insect Physiology，2007，53(10):1016-1026.

Liu ZY，Zhang FC，Wang Y，et al.Research of insect's antifreeze proteins［J］.Biotechnology，2004，14(3):73-75.［刘忠渊，张富春，王芸，等.昆虫抗冻蛋白的研究［J］.生物技术，2004，14(3):73-75］

Mahroof R，Yan ZK，Neven L，et al.Expression patterns of three heat shock protein 70 genes among developmental stages of the red flour beetle，Tribolium castaneum(Coleoptera:Tenebrionidae)［J］.Comp.Biochem.Physiol.B，Biochem.Mol.Biol.，2005，141(2):247-256.

Mao XF.Characterization and Functional Study of Antifreeze Protein from the Desert Beetle Anatolicapolita borealis［D］.Xinjiang:XinJiang University，2011.［毛新芳.新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白的性质及功能研究［D］.新疆:新疆大学，2011］

Mao XF，Zhang FC.The Purification and Properties Analysis of Insect Antifreeze Proteins［D］.Chinese Bulletin of Entomology，2009，46(1):26-32.［毛新芳，张富春.昆虫抗冻蛋白的分离纯化及特性分析［D］.昆虫知识，2009，46(1):26-32］

Ma J，Zhao G.The structures and biological proper ties of insect antifreeze proteins［J］.Biotechnology Bulletin，2006，5:37-44.［马纪，赵干.昆虫抗冻蛋白的结构与生物学特性研究［J］.生物技术通报，2006，5:37-44］

Ma YL，Hou F，Ma J.Seasonal changes in cold tolerance of desert beetle Anatolica polita borealis(Coleoptera:Tenebrionidae)and their physiological mechanisms［J］.Acta Entomologica Sinica，2009，52(4):372-379.［马延龙，候凤，马纪.荒漠昆虫光滑鳖甲的耐寒性季节变化及其生理机制［J］.昆虫学报，2009，52(4):372-379］

Mei ZX，Li JQ.The physiological mechanism and influential factors of insect cold tolerance［J］.Journal of Binzhou University，2006，22(3):57-61.［梅增霞，李建庆.昆虫抗寒性的生理机制及影响因子［J］.滨州学院学报，2006，22(3):57-61］

Micael R，Cristina PV，Ramiro MH，et al.A comparative study of the short term cold resistance response in distantly related Drosophila species:The role of regucalcin and frost［J］.PLoS ONE，2011，6(10):e25520.

Misra S，Crosby MA，MungallCJ，et al.Annotation of the Drosophila melanogaster euchromatic genome:a systematic review［J］.Genome Biol.，2002，3(12):0083-0083.22.

Morey AC，Hutchison WD，VenetteRC，et al.Cold hardiness of Helicoverpa zea(Lepidoptera:Noctuidae)pupae［J］.Environmental Entomology，2012，41(1):172-179.

Moseley PL.Heat shock proteins and heat adaptation of the whole organism［J］.Journal of Applied Physiology，1997，83:1413-1417.

Overgaard J，Malmendal A，Sorensen J，et al.Metabolomic profiling of rapid cold hardening and cold shock in Drosophila melanogaster［J］.J.Insect Physiol.，2007，53(12):1218-1232.

Peng SH，Yao PC，Xu N.The characteristics of antifreeze proteins and mechanism of action［J］.Progress in Physiological Sciences，2003，34(3):238-240.［彭淑红，姚鹏程，徐宁.抗冻蛋白的特性和作用机制［J］.生理科学进展，2003，34(3):238-240］

Qin Z.The Expression Analysis of TPS and Trehlgenes under Cold Induction in Harmonia axvridis［D］.Hangzhou:Hangzhou Normal University，2012.［秦资.异色瓢虫TPS 与Treh1 基因低温诱导表达分析［D］.杭州:杭州师范大学，2012］

Quesneville H，Bergman CM，Andrieu O，et al.Combined evidence annotation of transposable elements in genome sequences［J］.PLoS Comput.Biol.，2005，1(2):166-175.

Ritossa FM.A new pufing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila［J］.Experiantia.，1962，18(1):571-573.

Ritossa FM.Experimental activation of specific loci in polutene chromosomes of Drosophila［J］.Exp.Cell Res.，1964 35:601-607.

Shi AJ.Characteristics of Prepupal Diapause of Chrysopa pallens(Rambur)［D］.Shandong:Shandong Agricultural University，2007.［时爱菊.大草岭滞育特性的研究［D］.山东:山东农业大学，2007］

Shintani Y，Ishikawa Y.Relationship between rapid cold hardening and coldacclimation in the eggs of the yellow spotted longicorn beetle Psacothea hilaris［J］.Journal of Insect Physiology，2007，53:1055-1062.

Smith CD，Shu S，Mungall CJ，et al.The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin［J］.Science，2007，316(5831):1586-1591.

Sun LJ.Application of Antifreeze Protein from Xinjiang Desert Insect in the Preservation of Saccharomyces cereiseiae at Low Temperatures［D］.Xinjiang:Xinjiang University，2008.［孙琳杰.新疆荒漠昆虫抗冻蛋白在酿酒酵母低温保存中的应用［D］.新疆:新疆大学，2008］

Tian Y，Lu XY，Zhang HW.Advances in the antifreeze proteins［J］.Journal of Chinese Biology，2002，22(6):48-53.［田云，卢向阳，张海文.抗冻蛋白研究进展［J］.中国生物工程杂志，2002，22(6):48-53］

Tissieres A.Mitchell HK，Tracy UM.Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster:relation to chromosome puffs［J］.Journal of Molecular Biology，1974，84:389-398.

Tyshenko MG，Doucet D，Walker VK.Analysis of antifreeze proteins within spruce budworm sister species［J］.Insect Mol.Biol.，2005，14(3):319-326.

Wang HS，Wang XH，Zhou CS，et al.cDNA cloning of heat shock proteins and their expression in the two phases of the migratory locust［J］.Insect Mol.Biol.，2007，16(2):207-219.

Wang HS，Zhou CS，GuoW，et al.Thermoperiodic acclimations enhance cold hardiness of the eggs of the migratory locust［J］.Cryobiology，2006，53(2):206-217.

Wang JY，Ci ZL.Advances in study of heat shock protein［J］.Shanxi Forestry Science and Technology，2008，1:27-32.［王建义，慈忠玲.热激蛋白的研究进展.山西林业科技，2008，1:27-32］

Wang P，Ling F，Yu Y，et al.The dynamics of super-cooling ability and biochemical substances in the overwintering Carposina niponensi Walsingham(Lepidoptera:Carposinidae)larvae［J］.Acta Ecologica Sinica，2011，31(3):638-945.［王鹏，凌飞，于毅，等.桃小食心虫越冬幼虫过冷却能力及体内生化物质动态［J］.生态学报，2011，31(3):638-945］

Wang XH，Kang L.Differences in egg thermotolerance between tropical and temperate populations of the migratory locust Locusta migratoria(Orthoptera:Acridiidae)［J］.J.Insect Physiol.，2005，51(11):1277-1285.

Warren CJ，Mueller GM.Ice crystal growth suppression poly peptides and methods of preparation［J］.DNA Plant Technology Corp，1992，118:792-794.

Xu Q，Zou Q，Zheng H，et al.Three heat shock proteins from Spodoptera exigua:Gene cloning，characterization and comparative stress response during heat and cold shocks［J］.Comp.Biochem.Physiol.B，Biochem.Mol.Biol.，2011，159(2):92-102.

Yue CW，Zhang YZ.Cloning and expression of Tenebrio molitor antifreeze protein in Escherichia coli［J］.Mol.Bio.Rep.，2009，36:529-536.

Yue L，Guo JY，Zhou ZS，et al.Effects of cold acclimatization on insect cold hardiness and fitness［J］.Chinese Journal of Biological Control，2013，29(2):286-293.［岳雷，郭建英，周忠实，等.冷驯化对昆虫耐寒性及其适合度的影响［J］.中国生物防治学报，2013，29(2):286-293］

Yi SX，Lee RE.Rapid cold-hardening blocks cold induced apoptosis by inhibiting the activation of procaspases in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis［J］.Apoptosis，2011，16(3):249-255.

Zachariassen KE，Husby JA.Antifreeze effect of thermal hysteresis agents proteins highly supercooled insects［J］.Nature，1982，285-287.

Zhang FP，Zhong JH，Jiang BH，et al.Seasonal variation in cold tolerance of the population of pine armored scale，Hemiberlesia pitysophila Takagi(Homoptera:Diaspididae)［J］.Acta Ecologica Sinica，2009，29(11):5813-5822.［张飞萍，钟景辉，江宝福，等.松突圆蚧种群耐寒性的季节变化［J］.生态学报，2009，29(11):5813-5822］

Zhao J.Response to Cold Stress and Overwintering Strategy of Harmonia axyridis(Coleoptera:Coccinellidae)Adults［D］.Taian:Shandong Agricultural University，2011.［赵静.异色瓢虫低温胁迫耐受性及其越冬策略的研究［D］.泰安:山东农业大学，2011］

Zhao J，Cui NN，Zhang F，et al.Effects of body size and fat content on cold tolerance in adults of Harmonia axyridis(Pallas)(Coleoptera:Coccinellidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2010，53(11):1213-1219.［赵静，崔宁宁，张帆，等.异色瓢虫成虫体型及体内脂肪含量对其耐寒能力的影响［J］.昆虫学报，2010，53(11):1213-1219］

Zhao J，Chen ZZ，Zheng FQ，et al.Effects of cold acclimation on developmental characteristics and fitness of Harmonia axyridis(Coleoptera:Coccinellidae)offsprings［J］.Acta Entomologica Sinica，2012，55(7):810-815.［赵静，陈珍珍，郑方强，等.冷驯化对异色瓢虫后代生长发育及适合度的影响［J］.昆虫学报，2012，55(7):810-815］

Zheng XL.Studies on the Cold Hardening and Overwintering Regions of Spodoptera exiguain China［D］.Wuhan:Huazhong Agricultural University，2012.［郑霞林.甜菜夜蛾抗寒力及在中国的越冬区划研究［D］.武汉:华中农业大学，2012］

Zhong JH.Extreme Temperature Tolerance of Hemiberlesia pitysophila Takagi and Coccobius azumai Tachikawa［D］.Fuzhou:Fujian University，2009.［钟景辉.松突圆蚧及其天敌花角蚜小蜂对极端温度的耐受性［D］.福州:福建农林大学，2009］