龄期、饲养条件和测定方法对韭菜迟眼蕈蚊药剂敏感性的影响

张 鹏，李 慧，王秋红，陈澄宇，慕 卫，刘 峰

(山东农业大学，农药毒理与应用技术省级重点实验室，泰安 271018)

韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang 俗称韭蛆，是我国北方蔬菜生产上的一种重要害虫，其发生范围广，危害重，防治困难。由于常规杀虫剂对其田间防治效果不理想，导致一些地方菜农在韭菜上大量使用高毒、剧毒、长残留杀虫剂防治该虫，给人类身体健康带来严重威胁。随着全社会对绿色无公害蔬菜需求的增加，筛选高效、低毒、低残留的防治药剂成为当前的首要目标。目前韭蛆的室内生测方法主要有浸虫法(贾海民，2000)、胃毒触杀联合毒力法(慕卫，2002)两种。这两种方法在试虫龄期、试虫饲养条件(温度、饲料等)、浸药和调查时间等方面均缺乏统一标准(贾海民，2000;慕卫，2002，2004，2005;王萍，2011;张思聪，2011;李娜娜，2012)，如贾海民等(2000)采用4 龄幼虫，应用浸渍法将供试幼虫在药液中浸渍30 s，移到葱白上培养48 h 检查试验结果;慕卫等(2002)室内采用韭菜段饲养韭蛆至3 龄幼虫，然后用蘸有药液的滤纸加药液浸泡15 s 后的韭菜段测定杀虫剂的毒力，药后72 h 检查结果;张思聪等(2011)采用人工饲料饲养韭蛆至2 龄幼虫用于药剂毒力测定。处理方法及试虫条件的不一致不利于药剂的毒力评价和筛选。

温度不仅影响昆虫各虫态发育历期，还影响其体内生理代谢机能，尤其是与药剂相关的一系列靶标酶和代谢解毒酶的变化会直接影响昆虫对药剂的敏感性。吴刚(2008)等报道了测试温度对小菜蛾、菜缢管蚜和寄生蜂乙酰胆碱酯酶对药剂敏感性的影响，龚忱(2011)等报道了温度对拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶体躯分布的影响，但试虫的饲养温度对药剂敏感性的影响尚未见报道。从田间不同寄主植物上采自或选取室内饲喂不同食料的试虫进行药剂测定，可能会因食物营养成分不同而导致其体内与药剂相关的靶标酶系、解毒酶系在质(结构)或量(酶量)上发生变化(钦俊德，1987;张勇，2005)。Swingle(1939)发现南方灰翅夜蛾幼虫取食不同寄主植物叶片后，对砷化物的敏感性发生了变化;张勇(2005)等发现取食不同寄主的棉铃虫对溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性以及其体内代谢酶活性都发生显著变化;薛明(2005a，2005b)等采用韭菜、大葱、圆葱、大蒜室内饲喂韭蛆幼虫发现对其存活率影响较大，且对辛硫磷的敏感性也有差异。此外，试虫龄期也影响其对药剂的敏感性(陈丙坤，2009)。为此，本试验研究了龄期、饲养条件、生测方法等因素对韭蛆生测结果的影响，旨在为防治药剂的筛选和科学评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 试虫

于2012年11月，从山东省章丘市有机韭菜基地采集韭菜迟眼蕈蚊幼虫(韭蛆)，带回实验室内进行人工饲养。采用慕卫(2003)设计的韭菜迟眼蕈蚊人工饲养方法扩大繁殖后取适龄幼虫供试。饲养条件为温度25±1℃，湿度75±5%，自然光照。

1.2 饲料

韭菜(汉中韭)、大葱(中华巨葱)、圆葱(红太阳圆葱)、人工饲料(主要成分:蘑菇粉、韭菜粉、酵母粉、琼脂粉、防腐剂、维生素、水)根据于毅(2009)等人专利的制作工艺进行配制。

1.3 供试药剂

97%毒死蜱(Chlorpyrifos)原药(山东天成农药有限公司)、94%噻虫胺(Clothianidin)原药(日本住友化学株式会社)。将各原药参考国标的方法配制成简单剂型或母液。详细配制方法为40%毒死蜱乳油母液:41.2% 原药，48.8% 二甲苯，4.5%农乳500#，5.5%农乳600#;1%噻虫胺悬浮剂母液:1.04%原药，2%宁乳34#，0.20%黄原胶，96.76%去离子水，混合后加入锆珠，研磨2 h 制得。

1.4 试验方法

1.4.1 胃毒触杀联合毒力法

将洁净滤纸平铺在直径9 cm 的培养皿内，在滤纸上滴加1.2 mL 药液。将未用药的韭菜茎基的白色部分剪成1 cm 小段，取4 段于不同浓度药液中浸泡30 s 后取出，用吸水纸上吸去多余药液后置于铺有相同药液处理滤纸的培养皿内，然后用毛笔轻轻挑取大小一致的适龄幼虫放于培养皿内，并盖好皿盖。每皿接入试虫25 头左右，每处理重复3 次，同时设清水对照。放入25±1℃、相对湿度75±5%的无光培养箱中饲养。药后一定时间检查结果，以毛笔尖轻触虫体，幼虫不动或身体明显收缩者记为死亡。

1.4.2 人工饲料混药法

本实验室参照《农药室内生物测定试验准则》(2006)中的人工饲料混药法，并加以改进。具体方法为:称取已熔化的韭蛆人工饲料4.5 g，将稀释好的待测药剂母液0.5 g 均匀混入制作好的人工饲料中，制成混药饲料，待饲料凝固后切成0.5 cm3的小块。将药剂母液分别稀释10 倍，取1.0 mL 均匀滴加于平铺在直径9 cm 培养皿内的滤纸上。将切好的混药人工饲料小块置于铺有相同浓度药液处理滤纸的培养皿中央，然后将生长一致聚集成团的适龄幼虫用毛笔轻轻挑至培养皿饲料小块上。每皿接入试虫25 头左右，每处理重复3 次，同时设清水对照。其他试验操作、试验条件及结果检查同1.4.1。

1.4.3 浸虫法

将滤纸折成漏斗状，用毛笔轻轻挑起聚集成团且大小一致的适龄幼虫于滤纸中心，再用移液管吸取药液滴于漏斗中，幼虫在药液中浸泡30 s后，用吸水纸吸去漏斗中多余药液。将浸过药液的试虫用毛笔挑放在垫有干净滤纸(未用药液处理)的9 cm 培养皿内，滤纸上定量加水1.2 mL以保湿，放入新鲜韭菜茎段作饲料。每皿接入试虫25 头左右，每处理重复3 次，同时设清水对照。其他试验操作、试验条件及结果检查同1.4.1。

1.5 不同龄期韭蛆的毒力测定

分别采用2 龄和4 龄幼虫，以毒死蜱为试验药剂分别用胃毒触杀联合毒力法、人工饲料混药法和浸虫法进行室内毒力测定，重复3 次。

1.6 食料对韭蛆4 龄幼虫生测毒力的影响

分别取人工饲料、韭菜假茎、大葱植株近根部的地下茎和圆葱头作饲料，在室内分别连续饲养韭蛆至第二代，选取第二代4 龄幼虫采用胃毒触杀联合毒力法对毒死蜱、噻虫胺进行4 龄幼虫的室内生测试验，重复3 次。

1.7 饲养温度对韭蛆4 龄幼虫生测毒力的影响

设定4个温度梯度，在15℃、20℃、25℃、30℃饲养试虫至第二代，采用胃毒触杀联合毒力法在25℃下进行毒死蜱对韭蛆4 龄幼虫的室内生测试验。

1.8 生测方法对韭蛆4 龄幼虫生测毒力的影响

采用胃毒触杀联合毒力法、人工饲料混药法和浸虫法对毒死蜱、噻虫胺进行不同作用方式的室内毒力评价，以4 龄幼虫进行室内生测试验，重复3 次。

1.9 数据分析

生测数据采用DPS v7.05 软件分析整理(唐启义，2002)。同一生测方法不同龄期的敏感性倍数，以毒死蜱对 4 龄试虫的致死中浓度LC50(mg/L)为标准，计算毒死蜱对二龄试虫的LC50比值。同一方法同一药剂处理不同饲料饲养的韭蛆4 龄幼虫根据致死中浓度LC50(mg/L)，以毒死蜱对圆葱饲养的试虫的LC50为标准，计算毒死蜱对其余3种饲料饲养试虫的LC50比值，以噻虫胺对韭菜饲养的试虫的LC50为标准，计算噻虫胺对其余3种饲料饲养试虫的LC50比值。

2 结果与分析

2.1 幼虫龄期及生测方法对药剂毒力的影响

表1 结果表明，对于同龄幼虫，三种方法测得的LC50值均以浸虫法最高，人工饲料混药法次之，胃毒触杀联合毒力法最低;人工饲料混药法和胃毒触杀联合毒力法测得的LC50值差异性不显著。4 龄幼虫对药剂的耐受力显著高于2 龄幼虫。胃毒触杀联合毒力法、人工饲料混药法和浸虫法测得2 龄幼虫对毒死蜱的敏感性倍数分别为4 龄幼虫的11.9 倍、7.4 倍、3.3 倍。说明韭蛆幼虫龄期影响药剂毒力。

表1 三种生测方法测定毒死蜱对2 龄和4 龄幼虫的毒力Table 1 The toxicities of chlorpyrifos on 2nd and 4th instar larvae by three different bioassay methods

2.2 不同食料饲喂韭蛆对药剂毒力的影响

采用韭菜、大葱、圆葱、人工饲料饲养的试虫，测定毒死蜱、噻虫胺对韭蛆4 龄幼虫的毒力，结果结果见表2。不同食料饲养的韭蛆对两种药剂的敏感性存在较大差异。毒死蜱对取食韭菜、大葱、圆葱和人工饲料的韭蛆4 龄幼虫的LC50分别为69.399 mg/L、86.801 mg/L、127.965 mg/L、55.158 mg/L，取食韭菜、大葱、人工饲料的毒力分别为圆葱的1.84 倍、1.47 倍、2.31 倍。其中取食人工饲料的韭蛆对毒死蜱最为敏感，取食韭菜、大葱的较前者敏感性降低。噻虫胺对取食韭菜、大葱、圆葱和人工饲料的韭蛆4 龄幼虫的LC50分别为3.445 mg/L、2.850 mg/L、2.093 mg/L、3.092 mg/L，其中取食圆葱的对毒死蜱最为不敏感，取食韭菜、大葱及人工饲料的较前者敏感性升高。

表2 毒死蜱、噻虫胺对不同食料饲养幼虫的毒力Table 2 The toxicities to 4th instar larvae reared on different diets of chlorpyrifos and clothianidin

2.3 不同温度下饲养韭蛆对药剂毒力的影响

采用胃毒触杀联合毒力法测定了毒死蜱对不同温度下饲养韭蛆的毒力(表3)。48h 毒死蜱的LC50值分别113.680 mg/L、154.299 mg/L、224.190 mg/L、254.533 mg/L，72 h 的LC50值分别为35.891 mg/L、56.362 mg/L、71.433 mg/L、77.413 mg/L。在15-30℃，随饲养温度的升高毒死蜱的LC50值增大，但增大的幅度不断减小。从表3 中还可以看出，4个温度梯度饲养的试虫在药后48 h 的LC50与药后72 h 的LC50依次相差2.17 倍、1.74 倍、2.15 倍、2.29 倍。

表3 毒死蜱对不同温度下饲养的韭蛆4 龄幼虫的毒力Table 3 The toxicities to 4th instar larvae on different rearing temperatures to chlorpyrifos

2.4 不同生测方法测得的药剂对韭蛆4 龄幼虫的毒力

结果见表4。三种生测方法胃毒触杀联合毒力法、人工饲料混药法和浸虫法对韭蛆4 龄幼虫的LC50存在差异。三种测定方法测得毒死蜱对4 龄幼虫的LC50分别为67.199 mg/L、71.123 mg/L 和88.120 mg/L。噻虫胺对4 龄幼虫LC50分别为3.584 mg/L、2.255 mg/L、4.329 mg/L。可见，胃毒触杀联合毒力法测得的毒死蜱对4 龄幼虫的LC50最小，人工饲料混药法次之，浸虫法最高;而人工饲料混药测得的噻虫胺对4 龄幼虫的LC50最低，胃毒触杀联合毒力法次之，浸虫法最高。胃毒触杀联合毒力法和人工饲料混药法测得毒死蜱的LC50差异性不显著，但两者均明显高于浸虫法测得毒死蜱的LC50。三种方法测得噻虫胺的LC50存在明显差异。将两种药剂用不同生测方法所测得的毒力回归直线经拟合度卡方值检验，结果(卡方值均小于F0.05=7.82，P 均大于0.05)显示三种生测方法测得毒力回归直线都是合适的，但在浸虫法测得的毒力回归直线的拟合度要均比其他两种方法低(F浸虫法=1.5557＞F胃毒触杀联合毒力法=0.7564＞F人工饲料混药法=0.3013;F'浸虫法=1.2743＞F'胃毒触杀联合毒力法=0.8437＞F'人工饲料混药法=0.8386)。

表4 三种不同生测方法对韭蛆4 龄幼虫对毒死蜱、噻虫胺生测毒力曲线和LC50的影响Table 4 Effects of toxicity curve and LC50to 4th instar larvae on three different bioassay methods

(续上表)

3 结论与讨论

不同龄期试虫对药剂的敏感性存在显著差异。本研究采用胃毒触杀联合毒力法、人工饲料混药法、浸虫法测得2 龄幼虫对毒死蜱的敏感性分别为4 龄幼虫的11.9 倍、7.4 倍、3.3 倍。浸虫法测得的毒力敏感性差异最小，可能与其只体现了毒死蜱的触杀作用，而胃毒作用在韭蛆致死效应中起更大作用有关。另外试验中也发现，2 龄幼虫体型偏小，操作不便，容易因机械外力而死亡，且存在检查结果时其中毒症状难观察、死亡与否难以判定等问题。这与Cloyd(2006)等人在研究新烟碱类杀虫剂、苏云金杆菌对眼蕈蚊Bradysia spp.(Diptera:Sciaridae)的防治效果时建议不宜采用2龄幼虫进行试验的解释是一致的。

毒死蜱属于有机磷类杀虫剂，作用靶标是乙酰胆碱酯酶，其敏感度降低是昆虫对该类杀虫剂产生抗性的重要机制。薛明(2005b)等研究发现大葱、圆葱中含有硫醚类物质对韭蛆体内乙酰胆碱酶和代谢酶的诱导或抑制是引起药剂敏感性差异的重要原因。韭蛆幼虫长时间取食韭菜、人工饲料、大葱、圆葱后，其体内乙酰胆碱酶和代谢酶可能存在质或量的差异，导致毒死蜱对4种食料饲养的幼虫毒力显著差异。而噻虫胺属于新烟碱类杀虫剂，此类药剂作用于烟碱型乙酰胆碱受体。噻虫胺对取食上述4种食料幼虫的毒力存在差异，但其毒力大小顺序与毒死蜱的不同。因此，推测两种药剂表现出的差异可能与其作用机制有关。这种取食方面的差异对药剂对试虫敏感性的影响与张勇(2005)、Swingle(1939)、吴承春(2003)等人的研究结论一致。

温度不仅影响韭蛆各虫态的发育历期，还影响其体内的生理代谢功能。本试验在测定不同饲养温度对毒力的影响时，采用了同一生测温度。根据龚忱(2011)、吴刚(2003)等分别报道的温度对乙酰胆碱酯酶的体躯分布和药剂敏感性的影响的研究结果，本试验中饲养温度对乙酰胆碱酯酶在韭蛆体躯的分布及含量可能也存在影响，从而导致了毒死蜱对不同温度下饲养韭蛆的毒力变化，具体的生理生化机制还需要进一步探讨。室内饲养条件(温度、饲料等)的差异性，会导致试虫对药剂敏感性的差异。因此，室内不同饲养条件下的试虫测得药剂毒力无法进行比较，毒力测定必须选用同等条件下统一饲养的试虫。

胃毒触杀联合毒力法、人工饲料混药法和浸虫法均能够满足药剂对韭蛆的室内毒力测定要求，但胃毒触杀联合毒力法和人工饲料混药法优于浸虫法。浸虫法虽简单易行，但对非触杀型药剂毒力测定不够准确;胃毒触杀联合毒力法测定结果准确度高，但需确保韭菜、大葱等试验材料来源不受农药污染，需要避免浸药不充分、浸药后易腐烂等问题，否则会导致试验结果的波动;而采用改进的人工饲料混药法相对于胃毒触杀联合毒力法和浸虫法，测定结果准确度高，可以作为韭菜短缺时的一种替代方法。

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