环氧化酶－2反义核酸对膀胱癌细胞株裸鼠成瘤的影响

张军卫，靳风烁，龚晋迁，彭东涛，王 刚

（1.重庆市第九人民医院泌尿外科，重庆 400700；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042）

膀胱肿瘤是泌尿系最常见的恶性肿瘤，以非肌层浸润性膀胱癌为主，其主要特点为复发率高。近来国内外大量实验及流行病学资料表明结直肠癌、前列腺癌和膀胱癌等多种人类肿瘤COX－2（环氧化酶－2）的表达明显增高，使用COX－2抑制剂可使肿瘤增殖抑制，但是其机制目前尚不清楚。本研究探讨环氧化酶－2反义核酸对膀胱癌细胞株裸鼠成瘤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、菌株及质粒 人膀胱癌T24细胞株由本室冻存；含hCOX－2 全长cDNA 质粒pCB7，由美国大学Dubinett教授馈赠；pcDNA3.1（＋）质粒、pMD18－T Vector购于大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 人环氧化酶－2 反义核酸真核表达载体由本实验室的构建并鉴定。

1.1.3 裸鼠 6～8周龄BALB／c nu／nu裸鼠，均为雄性，由上海实验动物中心提供，本院动物室饲养。

1.1.4 主要试剂 脂质体lipofectAMINE 2000购自美国Roche 公司产品，胎牛血清购自美国Hyclone，鼠抗人COX－2单克隆抗体购自 北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞基因转染 应用脂质体介导的方法获得了稳定表达人环氧化酶－2反义核酸的膀胱癌细胞，并用抗生素筛选保证其稳定的表达，再通过免疫细胞化学与RT－PCR验证其COX－2蛋白及mRNA水平下调。

1.2.2 细胞培养人膀胱癌细胞株 T24、T24－AS、T24－P培养于含10%（体积分数）胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2（体积分数）饱和湿度的条件下生长、传代。

1.2.3 裸鼠成瘤性实验 分为3组（T24、T24－AS、T24－P），每组9只裸鼠。取对数生长期的T24细胞，用PBS将细胞制成细胞悬液（2.5×107／mL），抽取0.2mL接种于裸鼠背部皮下，接种后于无特殊病原菌（SPF）条件下饲养。从接种之日起，每隔7d测量肿瘤结节的长度（L）和宽度（W）。肿瘤体积计算公式为：V＝0.5236×L×W2。30d后处死裸鼠，取瘤块称重、测量肿瘤体积后，取少量组织块在10%（体积分数）中性甲醛中固定，梯度乙醇脱水，最后用石蜡包埋。

1.3 研究方法与观察指标 免疫组化、半定量RTPCR、Wester blot检测移植瘤COX－2 表达，光镜和电镜观察移植瘤形态学改变。

1.4 统计学处理 所有实验数据取，显著性检验用SPASS 19.0进行单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni法，假设检验的显著性水准取α＝0.05。

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤重量及体积测定 对照组T24、T24－P组细胞接种裸鼠后第5天可见肿瘤长出，反义核酸转染细胞T24－AS接种后第9天可见肿瘤长出。接种后第9天开始测量瘤体大小，以后每7d测量一次，共测量瘤体体积4次。30d后处死，剥离瘤体称重，3组裸鼠移植瘤平均重量、体积经方差分析表明，T24－AS成瘤性显著低于未T24、T24－P组，差异有显著性意义（P＜0.01），而T24与T24－P组裸鼠移植瘤间差异无显著性意义（P＞0.05），见表1。

表1 COX－2表达对T24膀胱癌裸鼠移植瘤重量和体积的影响 （）

表1 COX－2表达对T24膀胱癌裸鼠移植瘤重量和体积的影响 （）

＊与T24－P组比较，P＞0.05；△与T24和T24－P组比较，P＜0.01。

2.2 3 组裸鼠移植瘤的免疫组化染色结果比较T24、T24－P组免疫组化染色显示移植瘤细胞胞质和核膜呈深棕黄色，阳性细胞数量多，而T24－AS组仅少量细胞呈淡黄色染色。见图1。

图1 3组裸鼠移植瘤免疫组化染色（倒置显微镜，×200）

2.3 RT－PCR与Western blot检测结果 T24、T24－P组均显示COX－2表达明显，而T24－AS组均少量表达，见图2、图3。

图2 移植瘤COX－2表达RT－PCR检测

图3 移植瘤COX－2表达Western blot检测

2.4 裸鼠移植瘤病理结果 荷瘤鼠解剖后肉眼观移植瘤均呈圆形或椭圆形，表面有结节状突起，瘤外有不完整的包膜，质中等、切面呈实性、灰白色，中心有些有出血、坏死，T24组可见部分肿瘤侵犯肌肉及皮肤。

2.4.1 光镜检查 T24、T24－P 组见肿瘤细胞大小不一、异型性明显，坏死区均一粉染，癌细胞呈圆形、椭圆形、多角形或梭形，胞核大，核浆比例大，有的胞质较空亮，病理性核分裂相多见，癌细胞弥漫性浸润。而T24－AS组肿瘤表现类似，但凋亡细胞明显增多，细胞固缩、胞质浓缩、核浓缩成块状、深染集中于核膜下，细胞间连接松解，细胞离散，出现细胞凋亡，细胞间可见炎性细胞浸润，有的细胞崩解成碎片，见图4。

图4 3组裸鼠移植瘤光镜下结果（HE，×400）

2.4.2 透视电镜检查 T24、T24－P 组细胞见癌细胞大小及形态各异排列不规则，癌细胞呈圆形、椭圆形和不规则形，常染色质增多，常见双核、多核。瘤细胞表面非对称单位膜结构丧失，胞质较少、梭形小泡消失，线粒体常见不同程度空泡化，可见大量游离核糖体、糖原颗粒，张力微丝增多，细胞间松散。T24－AS组可见凋亡小体出现，凋亡细胞增多，凋亡细胞细胞膜完整，胞体皱缩形成突起，胞质浓缩核仁消失，异染色质边集，碎裂成团块状沿核膜分布，见图5。

图5 3组裸鼠移植瘤透视电镜下结果（TEM，×5 000）

3 讨论

膀胱肿瘤居全身恶性肿瘤发病率的第9位，是我国泌尿系最常见的恶性肿瘤，2008年统计膀胱癌死亡率为2.63／105，占中国恶性肿瘤死亡构成的1.42%，膀胱癌以非肌层浸润性生长为主，术后复发率高达30%～85%，目前化疗的有效率仅为15%～20%［1－2］。2012年美国癌症协会统计报告示新发的膀胱癌有73 510 例，而死于膀胱癌达14 880 例［3］。近20年来膀胱癌的诊断方法、治疗手段以及对其发病机制的研究有很大进展，而遗憾地是其预后没有明显的改善。

近年来国内外大量实验及流行病学资料表明结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌和膀胱癌等多种人类肿瘤COX－2的表达明显增高，使用COX－2抑制剂可抑制肿瘤增殖，表明COX－2在肿瘤的发生发展过程中起重要作用［4］。COX 具有两个亚型，COX－1在多种组织中均有表达，与组织自身稳定有关；COX－2在多数组织中正常生理情况下无明显表达，但当受到一些细胞因子或有丝分裂原诱导时表达增高，与炎症、肿瘤等病理过程有关［5－6］。

在本实验中经过基因转染获得了稳定表达人环氧化酶－2反义核酸的膀胱癌细胞，并通过免疫细胞化学与RT－PCR证实其COX－2蛋白及mRNA 水平显著下降，表明转染是成功的，并且得到稳定表达。但基因的封闭往往不能达到百分之百，尚有部分COX－2的表达，这为研究COX－2表达差异对裸鼠成瘤性的影响提供了实验基础。经过RT－PCR 和Western blot及免疫组化染色均证实反义COX－2核酸转染膀胱癌细胞所建立的移植瘤T24组的COX－2表达较未转染及转染空质粒的移植瘤T24和T24－P组明显减少，而实验中COX－2表达与裸鼠移植瘤的形成呈正相关，说明通过抑制其表达可成为抗肿瘤的新途径，与文献报道一致［7－9］。

NSAIDs（非甾体类抗炎药）为一类不含类固醇的甾体结构而具抗炎、止痛和解热作用的药物，70年代以来得到了迅速发展。目前大量研究表明COX－2选择性抑制比传统的NSAIDs更为安全有效，有较佳的胃肠耐受性而抗炎活性相当，目前已上市的有塞来昔布、尼美舒利、美洛昔康、NS－398等。一项流行病学调查显示塞来昔布是结直肠腺瘤和结直肠癌发生的保护因素，研究者发现塞来昔布400mg每日两次，连用6个月可显著降低FAP 患者的结直肠息肉数目。选择性COX－2抑制剂对其他肿瘤的预防和治疗作用也有报道。Barrett's食管是癌前病变，目前尚无确切的证据证明药物或外科手术能使其逆转，联合应用抑酸剂和选择性COX－2抑制剂可能是最有效的化学预防策略。

近年研究表明COX－2有可能通过其合成的PGs促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进肿瘤相关血管形成以及使局部免疫抑制等参与肿瘤的生长、浸润、转移等多种恶性行为，参与肿瘤发展过程中的相关分子机制，P53基因或ras基因突变的细胞COX－2表答也增强，它们之间可能存在协同作用［10－11］。以COX－2为靶点抑制肿瘤的机制尚不清楚，其抗肿瘤作用途径可能是多方面的，可能与阻断前列腺素的合成，起到抑制肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成、肿瘤转移的作用有关，或者是通过不同途径抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡［12－13］。COX－2抑制剂除了可以抑制COX－2 以上作用外，还可以产生一些不依赖于COX－2的作用。最近有报道应用塞来昔布辅助化疗治疗膀胱癌，但样本数量有限，未来大宗的前瞻性的研究可能会给临床应用提供有力的证据［14－15］。

本实验只是对COX－2在膀胱肿瘤形成中的作用机制进行了初步的探讨，COX－2 基因阻断治疗体内实验中表现出良好的抗肿瘤特性，支持了COX－2与肿瘤密切相关，尽管走向临床应用还需要过更多的研究，但无疑这些努力将会对膀胱癌的治疗产生深远影响。

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