希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶生物信息学分析

韩长志

摘要：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、萝卜等众多十字花科蔬菜引起炭疽病，给生产造成巨大的经济损失。通过对该菌中可能的腺苷酸环化酶（AC）氨基酸序列进行理化性质、细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析。结果表明，该菌种ChCap1，ChCap2与Srv2在理化性质、二级结构、亚细胞定位方面差异较大，以期为深入开展AC基因的定位、表达以及功能域等方面研究及为进一步实现以控制病原菌G蛋白信号途径功能新药物靶标的开发提供有力的理论支撑。

关键词：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）;腺苷酸环化酶;理化性质;亚细胞定位;二级结构

中图分类号：S763        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）20-4992-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.061

Bioinformatics Analyses of Adenylate Cyclase of Colletotrichum higginsianum

HAN Chang-zhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control

of Yunnan Province， Kunming  650224， China）

Abstract：Colletotrichum higginsianum can infect flowering Chinese cabbage， carrot and other cruciferous vegetables， causing huge economic losses to the production. Based on our previous research， bioinformatics analyses of the typical adenylate cyclase （AC） sequence including the physicochemical properties， signal peptide， trans-membrane domain structure and the secondary structure were made. The results showed that there were differences in physicochemical properties， secondary structure，subcellular locatization between chCap1，chCap2 and Srv2. It will provide theoretical basis for developing new drug targets to control pathogen cell division and gene mapping of AC gene.

Key words：Colletotrichum higginsanum;adenylate cyclase;physicochemical properties;subcellular localization;secondary structure

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、小油菜、大白菜、萝卜、结球甘蓝、羽衣甘蓝等十字花科蔬菜植物而引起炭疽病，是一类重要的世界性植物真菌病害[1-3]。目前，由该菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心最常见的严重病害之一[4]。该病对广东菜心种植地区产生重大影响，不仅降低了菜心产量，也影响着菜心品质[5，6]。生产上对炭疽病的防治多采用多菌灵、甲基托布津、苯菌灵等苯并咪唑类化学药剂，而由于该类药剂作用靶标以及作用时间的特殊性容易引起炭疽菌产生抗药性，严重地制约着上述药剂的进一步使用。同时，与禾谷炭疽菌同属炭疽菌属的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）对多菌灵的抗药性受到广泛关注[7-12]，而生产上尚未有新的有效药剂用于炭疽病的防治。

植物与病原菌互作过程中，许多细胞信号转导途径共同作用从而完成对外界环境刺激、内部信号传递以及应对反应处置等。其中，尤以将外界信号传递到细胞内部的G蛋白（鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，Guanine nucleotide binding protein）信号途径所发挥的作用最大。腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase， AC）作为G蛋白信号通路调节的重要因子发挥重要作用，其功能主要是将cAMP转化为5-AMP，从而完成信号的终止过程。通过对该酶功能的深入解析，有助于为今后开发以此为药剂靶标的化学农药提供重要的理论指导。目前，对于希金斯炭疽菌的AC研究却鲜有报道，前期通过对酿酒酵母（S. cerevisiae）S288c含有的1个典型AC（Srv2）氨基酸序列，利用炭疽菌属蛋白质数据库进行Blast比对及关键词搜索[13];同时，通过SMART保守结构域分、理化性质、细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析，明确与Srv2同源的希金斯炭疽菌AC相关蛋白ChCap1、ChCap2分别位于AC的C端和N端。

本研究基于前期研究，通过保守结构域分析、疏水性分析、二级结构预测、信号肽分析以及跨膜区结构分析、亚细胞定位等生物信息学分析，以期明确该菌AC理化性质、结构特征以及定位情况，同时，对其进行同源序列之前的遗传关系分析，以期为进一步开展同属于炭疽菌属但其基因组序列尚未公布的其他炭疽菌研究提供重要的理论指导。endprint

1  材料与方法

1.1  材料

根据前期遗传关系分析，禾谷炭疽菌与希金斯炭疽菌在AC同源序列方面存在较近的关系，由于ChCap1、ChCap2分别位于AC的C端和N端，对上述合并序列进行生物信息学分析，发现其理化性质、亚细胞定位以及二级结构特性与Srv2有较大的差异，因此选择禾谷炭疽菌的AC序列中的中间序列作为希金斯炭疽菌的中间序列，从而开展后续生物信息学分析（表1）。

1.2  生物信息学分析

1.2.1  保守结构域预测  利用SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线分析希金斯炭疽菌中AC蛋白序列所具有的保守结构域特征。

1.2.2  蛋白质理化性质预测  利用蛋白质数据库（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）在线进行分析预测AC相关蛋白序列的等电点、分子质量及氨基酸组成等特征。

1.2.3  蛋白质疏水性预测  利用Protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）对希金斯炭疽菌中AC相关蛋白序列进行疏水性测定。

1.2.4  蛋白质转运肽及信号肽预测  对蛋白质转运肽（transit peptide）的预测利用TargetP 1.1 Server在线分析实现（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[14]。氨基酸信号肽（Signal peptide）的预测则是利用SignalP 3.0 Server[15]在线分析实现（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）。在线预测信号肽使用神经网络方法（Neural networks， NN）和隐马可夫模型（Hidden markov models， HMM）进行操作，而根据算法不同得出的结果有所差别。

1.2.5  蛋白质二级结构及跨膜区结构预测  对蛋白质二级结构预测采用PHD[16]在线分析实现（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）。同时，对希金斯炭疽菌中AC相关蛋白序列的跨膜区结构预测，利用TMHMM Server v. 2.0实现（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）[15]。

1.2.6  亚细胞定位分析  对希金斯炭疽菌中AC相关蛋白序列进行亚细胞定位分析，利用ProtComp v9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）实现[17]，以期获得蛋白质的定位情况。

2 结果与分析

2.1  保守结构域预测结果

基于SMART分析网站，对ChCap1、ChCap2合并序列进行保守结构域分析。结果表明，Srv2在C端含有两个相同的CARP保守结构域，合并序列也含有两个CARP保守结构域，将其初步命名为腺苷酸环化酶蛋白（Adenylate cyclase protein），ChSrv2（图1）。

2.2  ChSrv2与Srv2氨基酸组成分析结果

根据组成蛋白质的氨基酸残基的理化性质，将其分为酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性R基氨基酸、不带电荷的极性R基氨基酸等四大类。对ChSrv2与Srv2中氨基酸残基组成进行对比分析。结果表明，ChSrv2与Srv2的氨基酸数量以及所占比例、所含最高（最低）比例氨基酸及其所占比例方面均具有较大的一致性（表2）。Srv2所含最高比例的氨基酸为丝氨酸（Ser），比例为11.00%，而ChSrv2含最高比例的氨基酸也为Ser，比例为9.60%;在所含最低比例的氨基酸方面，Srv2为半胱氨酸（Cys），比例为0.80%，ChSrv2也为Cys，最低比例为0.40%（表2）。

2.3  Srv2与ChSrv2理化性质分析结果

Srv2与ChSrv2在氨基酸数量、相对分子质量、理论等电点、负电荷氨基酸残基数、正电荷氨基酸残基数、分子式以及原子数量、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性等方面均存在着较大的一致性，特别是在理论等电点、不稳定系数，ChCap2与Srv2相似，理论等电点属于酸性范围内，不稳定系数均大于40，属于不稳定蛋白;ChCap1与Srv2则具有较大的差异，其理论等电点属于偏碱性范围，其不稳定系数小于40，为稳定蛋白（表3）。

2.4  转运肽和信号肽特征

转运肽是一种由12～60个氨基酸残基所组成的前导序列，其功能为引导那些在细胞溶质中合成的蛋白质进入线粒体和叶绿体等细胞器。除了细胞信号蛋白外各种内在蛋白均利用导肽到达细胞器。通过分析，Srv2与ChCap1、ChCap2均定位于分泌途径上，其预测值分别为0.883、0.701、0.660，所处的概率有所不同（表4）。就信号肽预测而言，无论是根据NN进行计算，还是根据HMM进行计算，Srv2与ChCap1、ChCap2均不含有信号肽。

2.5  蛋白疏水性预测结果

根据Protscale分析可知，ChCap1位于36位的丝氨酸（S），其亲水性最强，为-1.926，而位于129位的脯氨酸（P），其疏水性最强（亲水性最弱，下同），为1.626;ChCap2位于54位的苏氨酸（T），其亲水性最强，为-1.005，而位于174位的丙氨酸（A），其疏水性最强，为1.626。Srv2在亲水性（疏水性）最强的氨基酸及其所在位置方面均存在着较大的不同（图2）。endprint

对Srv2与ChCap1、ChCap2的疏水性、亲水性数值进行统计分析。结果表明，3种蛋白在亲水性最强氨基酸残基位置、数值，疏水性最强氨基酸残基位置、数值，疏水性氨基酸残基数值总和以及亲水性氨基酸残基数值总和等方面均存在着较大差异，惟一的相同点是均为亲水性蛋白，这与通过GRAVY计算所得结果一致。

2.6  亚细胞定位特征

通过分析表明，希金斯炭疽菌ChSrv2亚细胞定位与Srv2相同，均定位于质膜上，这与前人对腺苷酸环化酶定位于细胞膜上的研究相一致。

2.7  Srv2在二级结构特征方面与ChCap1、ChCap2存在较大差异

通过分析表明，与Srv2相同，ChCap1、ChCap2均没有典型的跨膜结构。对其二级结构进行分析表明，在二级结构组成方面，ChCap1、ChCap2与Srv2存在着较大差异（图3）。

3  小结与讨论

作为炭疽菌属中重要的病原菌，希金斯炭疽菌主要危害十字花科蔬菜，造成重要的经济损失，国内外学者对其开展了全面而深入的研究。然而，生产上对其引起的炭疽病多采用苯并咪唑类化学药剂防治，而由于该药剂作用靶标以及作用时间的特殊性，均容易引起炭疽菌抗药性出现，严重地制约着上述药剂的进一步使用，急需开发用于防治炭疽病的新作用机制化学药剂，从而较好地挽回生产上的经济损失。

近年来，关于AC在酵母[18]、稻瘟菌[19]、大豆疫霉[20]等真核生物中的功能研究已积累了较多的试验数据，而对于危害禾本科植物造成严重损失的禾谷炭疽菌的AC研究却鲜有报道，随着该病菌全基因组序列的公布，国内外学者对其开展致病基因、抗药性基因的研究将日趋深入。本研究基于酿酒酵母中已经报道的Srv2，利用Blast比对、关键词搜索以及通过SMART保守结构域分析、细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析，明确该菌中ChCap1、ChCap2与Srv2在理化性质、二级结构、亚细胞定位方面均具有较大的差异性，同时，通过对上述两个腺苷酸环化酶相关蛋白与其他物种中的同源序列进行Blast比对分析，明确ChCap1、ChCap2分别是希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶蛋白序列的重要组成部分，其分别位于N端和C端。通过对其进行序列合并，并结合其SMART保守结构域分析、理化性质、细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构、亚细胞定位等生物信息学分析，结果表明合并后的序列在上述特征、性质方面与Srv2具有较大的相似性。该研究为进一步解析希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶的序列以及功能研究提供重要的理论指导。

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