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松散型花椰菜小孢子植株再生研究

2014-12-09单晓政文正华刘莉莉姚星伟江汉民

天津农业科学 2014年6期

单晓政+文正华+刘莉莉+姚星伟+江汉民+吴峰+牛国保+孙德岭

摘 要:以松散型花椰菜子叶型小孢子胚为外植体,研究冷处理、活性炭及AgNO3对小孢子植株再生的影响。结果表明:对小孢子胚进行3 d的4 ℃冷处理培养,能提高其胚芽诱导率和胚芽数;培养基中添加1.0 g·L-1的活性炭对提高小孢子胚芽诱导率没有明显效果,但能有效减轻胚芽的玻璃化;添加5.0~7.0 mg·L-1的AgNO3对小孢子胚芽诱导有显著效果。

关键词:松散型花椰菜;小孢子胚;植株再生

中图分类号:S635.3 文献标识码:A DOI 编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.001

相对于紧实型花椰菜,松散型花椰菜花球松散、梗青球白、生脆可口、味道鲜美,近年来逐渐赢得我国消费者的喜爱,种植面积不断扩大。利用游离小孢子技术获得松散型花椰菜小孢子植株或DH群体已有报道[1],虽然松散型花椰菜小孢子培养的产胚率相对较高,但小孢子胚在分化和继代培养中,仍然存在褐化、玻璃化、愈伤化、停止生长和畸形生长等现象,直接影响小孢子植株的再生率。已有报道称基因型、胚龄、琼脂浓度、培养基添加物等都是影响小孢子植株再生的重要因素[2-3],而适当的冷处理、干燥处理、子叶切除等能提高小孢子胚的植株再生能力。

本文探讨了冷处理、活性炭和AgNO3对松散型花椰菜小孢子植株再生的影响,旨在进一步完善游离小孢子培养体系,并为该技术在蔬菜育种中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

‘津松65、‘津松70等8个松散型花椰菜品种由天津科润蔬菜研究所花椰菜课题组提供。

1.2 方 法

将供试材料进行游离小孢子培养,培养方法参考顾宏辉[1]的方法,将获得的子叶型小孢子胚状体置于光照下,转绿后,即可用于小孢子胚芽诱导试验。将变绿后的子叶型胚转入基本培养基(MS+6-BA0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂13.5 g·L-1)中进行培养,其中以高出胚率品种‘津松65和‘津松70的小孢子胚为试材,研究冷处理、活性炭和AgNO3对小孢子胚芽诱导的影响。3种处理设置条件为:将刚转入固体培养基的胚置于光照培养箱中4 ℃冷处理3 d,以冷处理0 d为对照;在基本培养基中添加1.0 g·L-1活性炭,以不添加活性炭为对照;在基本培养基中分别添加1.0,3.0,5.0,7.0,9.0 mg·L-1的AgNO3,以不添加AgNO3为对照。每个处理接种小孢子胚24个,3次重复,25 d后统计胚芽诱导率和胚芽数。胚芽诱导率=出芽胚状体数/接种胚状体数×100%。

2 结果与分析

2.1 冷处理对小孢子胚芽再生的影响

对2个供试材料的小孢子胚进行3 d的冷处理后,胚芽诱导率和出芽数均有显著提高(表1)。经冷处理后,‘津松65的胚芽诱导率由52.0%提高到了83.0%,平均出芽数也由2.37 个·胚-1增加到2.89个·胚-1,‘津松70的胚芽诱导率由61.8.0%提高到88.3%,而平均出芽数由0.68个·胚-1提高到了1.83个·胚-1。

2.2 活性炭对小孢子胚芽再生的影响

活性炭处理后,2个供试材料的小孢子胚芽诱导率和出胚数与对照相比差异不显著(表2)。

但在添加活性炭的培养基中生长的胚芽出现玻璃化的概率减小,并且长成的幼苗比较健壮,成活率较高,而未添加活性炭的培养基中的胚芽玻璃化现象较严重。

2.3 AgNO3在小孢子胚芽再生中的作用

从表3可以看出,在培养基中分别添加5.0~7.0 mg·L-1的AgNO3,小孢子胚芽分化率和胚平均出芽数与不添加AgNO3相比均差异显著。‘津松65在添加7.0 mg·L-1的AgNO3时,胚芽诱导率提高到83.7%,添加了5.0 mg·L-1的AgNO3后,平均出芽数达到2.85个·胚-1,‘津松70在添加5.0 mg·L-1的AgNO3后,胚芽诱导率提高到98.2%,而平均出芽数由0.76个·胚-1提高到了2.26个·胚-1。这表明在培养基中附加5.0~7.0 mg·L-1的AgNO3可显著提高松散型花椰菜小孢子胚芽诱导率和每个胚状体分化芽的数量。

2.4 再生苗的继代、生根和移栽

将获得的胚芽切下接种到继代培养基中,之后每20~30 d继代1次,可以使芽苗长得健壮。经继代3~4次的芽苗接种到含NAA的生根培养基中,15 d左右即可长出健壮的根系,通常经继代的芽苗较不经继代的芽苗生根速度快、根短粗、成活率高。将组培苗移栽到自然环境生长前要炼苗1~2 d,之后移栽于含蛭石∶草炭(1∶2)的营养钵中,并进行遮荫保湿。

3 结论与讨论

冷处理、活性炭和AgNO3在小孢子培养中的作用已有大量报道,但在小孢子植株再生中的作用研究较少。Ritala[4]对大麦小孢子胚进行4个星期的4 ℃处理,可以明显提高生成苗的效率;周伟军等[5]对油菜小孢子再生研究时发现,在胚状体移入固体再生培养基后立即进行10 d的低温诱导处理(2 ℃),常温光下培养,可以直接、快速再生成苗,成苗率达62.5%,且再生植株的生长状况与无低温诱导的再生植株无明显区别;Zhang[6]对油菜小孢子胚状体进行3 d或5 d的冷处理,能使胚发芽率和成苗率分别提高到90.0%和58.48%。本试验将小孢子胚在4 ℃处理3 d,发现胚芽诱导率最高可达到90%以上,说明冷处理对提高胚芽的再生确实有效。

韩阳[7]在大白菜小孢子植株再生研究中发现,培养基中添加200 mg·L-1活性炭可以大幅度提高小孢子胚成苗率,其原理可能是活性炭吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些物质。其他研究者也曾报道活性炭对小孢子胚状体发生有很好的促进作用。本研究发现添加活性炭与未添加活性炭小孢子胚芽诱导无明显差异,这可能跟活性炭浓度有关,活性炭浓度较高反而对胚芽诱导没有明显促进作用。但是,本试验中发现,在添加活性炭的培养基中生长的胚芽在之后的培养中玻璃化现象明显减轻,这说明活性炭可能在克服小孢子胚芽玻璃化方面有重要作用。

AgNO3作为一种乙烯抑制剂经常被用于植物离体培养中。许多研究指出,在植物离体培养中,AgNO3不仅能提高芽诱导率,还能有效抑制褐化。唐桂香[8]发现,培养基中添加AgNO3能显著提高甘蓝型油菜子叶的不定芽分化诱导率。赵秀枢[9]发现,AgNO3在羽衣甘蓝不定芽诱导过程中起抑制作用。高红亮[10]在不结球白菜离体再生研究中发现添加5~10 mg·L-1AgNO3可显著提高不定芽分化率和每个外植体分化芽的数量。杨晓枫[11]发现,甘蓝型油菜外植体愈伤组织诱导率和芽再生率与AgNO3密切相关。本试验将AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中,也发现适宜浓度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽诱导率和再生率,但浓度过高对胚芽再生起抑制作用。

参考文献:

[1] 顾宏辉,朱丹华,杨加付. 小孢子培养获得松花型花椰菜DH再生植株[J]. 农业生物技术学报,2007,15(2):301-305.

[2] 刘凡,李岩,姚磊,等. 培养基水分状况对大白菜小孢子胚成苗的影响[J].农业生物技术学报, 1997, 5(2):131-136.

[3] 牛应泽,刘玉贞,汪良中,等.人工合成甘蓝型油菜游离小孢子培养及其植株再生研究初报[J].四川农业大学学报, 1999,17(2):167-171.

[4] Ritala A, Mannonen L, Oksman-Caldentey K M. Factors affecting the regeneration capacity of isolation barley microspores (Hordeum vulgare L.)[J]. Plant Cell Rep, 2001,20(5):403-407.

[5] 周伟军,毛碧增,顾宏辉,等. 秋水仙碱及热击与低温对油菜小孢子胚状体成苗率的影响[J].作物学报, 2003, 28(3):369-373.

[6] Zhang G Q, Zhang D Q, Tang G X. Plant development from microspore-derived embryos in oilseed rape as affected by chilling, desiccation and cotyledon excision[J]. Biologia Plantarum, 2006, 50(2):180-186.

[7] 韩阳,叶雪凌,冯辉. 提高大白菜小孢子植株获得率的研究[J].园艺学报, 2005, 32(6):1 092-1 094.

[8] 唐桂香,周伟军.AgNO3对甘蓝型油菜子叶外植体再生的影响[J].中国油料作物学报,2001,23(3):9-12.

[9] 赵秀枢,李名扬,张文玲.观赏羽衣甘蓝高频再生体系的建立[J]. 基因组学与应用生物学,2009,28(1):141-148.

[10] 高红亮, 李英, 宋玉萍. 不结球白菜离体培养与植株再生体系研究[J]. 西北植物学报, 2008, 28(5):963-968.

[11] 杨晓风,秦波,周伟军. 二步培养和AgNO3对甘蓝型油菜子叶和下胚轴芽再生的影响[J]. 中国油料作物学报. 2009,31(2):137-142.

AgNO3作为一种乙烯抑制剂经常被用于植物离体培养中。许多研究指出,在植物离体培养中,AgNO3不仅能提高芽诱导率,还能有效抑制褐化。唐桂香[8]发现,培养基中添加AgNO3能显著提高甘蓝型油菜子叶的不定芽分化诱导率。赵秀枢[9]发现,AgNO3在羽衣甘蓝不定芽诱导过程中起抑制作用。高红亮[10]在不结球白菜离体再生研究中发现添加5~10 mg·L-1AgNO3可显著提高不定芽分化率和每个外植体分化芽的数量。杨晓枫[11]发现,甘蓝型油菜外植体愈伤组织诱导率和芽再生率与AgNO3密切相关。本试验将AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中,也发现适宜浓度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽诱导率和再生率,但浓度过高对胚芽再生起抑制作用。

参考文献:

[1] 顾宏辉,朱丹华,杨加付. 小孢子培养获得松花型花椰菜DH再生植株[J]. 农业生物技术学报,2007,15(2):301-305.

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[3] 牛应泽,刘玉贞,汪良中,等.人工合成甘蓝型油菜游离小孢子培养及其植株再生研究初报[J].四川农业大学学报, 1999,17(2):167-171.

[4] Ritala A, Mannonen L, Oksman-Caldentey K M. Factors affecting the regeneration capacity of isolation barley microspores (Hordeum vulgare L.)[J]. Plant Cell Rep, 2001,20(5):403-407.

[5] 周伟军,毛碧增,顾宏辉,等. 秋水仙碱及热击与低温对油菜小孢子胚状体成苗率的影响[J].作物学报, 2003, 28(3):369-373.

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[11] 杨晓风,秦波,周伟军. 二步培养和AgNO3对甘蓝型油菜子叶和下胚轴芽再生的影响[J]. 中国油料作物学报. 2009,31(2):137-142.

AgNO3作为一种乙烯抑制剂经常被用于植物离体培养中。许多研究指出,在植物离体培养中,AgNO3不仅能提高芽诱导率,还能有效抑制褐化。唐桂香[8]发现,培养基中添加AgNO3能显著提高甘蓝型油菜子叶的不定芽分化诱导率。赵秀枢[9]发现,AgNO3在羽衣甘蓝不定芽诱导过程中起抑制作用。高红亮[10]在不结球白菜离体再生研究中发现添加5~10 mg·L-1AgNO3可显著提高不定芽分化率和每个外植体分化芽的数量。杨晓枫[11]发现,甘蓝型油菜外植体愈伤组织诱导率和芽再生率与AgNO3密切相关。本试验将AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中,也发现适宜浓度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽诱导率和再生率,但浓度过高对胚芽再生起抑制作用。

参考文献:

[1] 顾宏辉,朱丹华,杨加付. 小孢子培养获得松花型花椰菜DH再生植株[J]. 农业生物技术学报,2007,15(2):301-305.

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[3] 牛应泽,刘玉贞,汪良中,等.人工合成甘蓝型油菜游离小孢子培养及其植株再生研究初报[J].四川农业大学学报, 1999,17(2):167-171.

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[5] 周伟军,毛碧增,顾宏辉,等. 秋水仙碱及热击与低温对油菜小孢子胚状体成苗率的影响[J].作物学报, 2003, 28(3):369-373.

[6] Zhang G Q, Zhang D Q, Tang G X. Plant development from microspore-derived embryos in oilseed rape as affected by chilling, desiccation and cotyledon excision[J]. Biologia Plantarum, 2006, 50(2):180-186.

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[8] 唐桂香,周伟军.AgNO3对甘蓝型油菜子叶外植体再生的影响[J].中国油料作物学报,2001,23(3):9-12.

[9] 赵秀枢,李名扬,张文玲.观赏羽衣甘蓝高频再生体系的建立[J]. 基因组学与应用生物学,2009,28(1):141-148.

[10] 高红亮, 李英, 宋玉萍. 不结球白菜离体培养与植株再生体系研究[J]. 西北植物学报, 2008, 28(5):963-968.

[11] 杨晓风,秦波,周伟军. 二步培养和AgNO3对甘蓝型油菜子叶和下胚轴芽再生的影响[J]. 中国油料作物学报. 2009,31(2):137-142.