猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株的分离与鉴定

2014-12-09张美玲简子健陆桂丽等

天津农业科学 2014年11期

张美玲　简子健　陆桂丽等

摘要：为了解猪繁殖与呼吸道综合征在新疆的流行现状，以及病毒毒株的分子生物学特征，对疑似该病病料进行地方毒株的分离，并对其进行鉴定。采集新疆乌鲁木齐市七道湾某猪场疑似PRRS病死的猪只肺脏及淋巴结等组织病料，将其处理后接种到Marc-145细胞上，并盲传3代；对分离株进行毒力测定（TCID50），应用RT-PCR方法对出现CPE的细胞培养物进行分子检测。结果显示，分离到的新疆病毒株可发生细胞病变，在Marc-145细胞上的TCID50为10-5·mL-1。RT-PCR检测结果用琼脂糖凝胶电泳鉴定基因序列，将测序结果与GenBank已发表的PRRSV毒株基因序列进行对比分析。研究证明所分离到的病毒为PRRSV，命名为XJ-Q。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离；鉴定

中图分类号：S852.651 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.008

猪繁殖与呼吸道综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗称蓝耳病，是猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病。其临床特征是仔猪出现不同程度的呼吸道病症及待产母猪的繁殖障碍，如木乃伊胎、弱仔、死胎或流产，死亡率高[1]。该病于20世纪80年代末、90年代初在美国报道，而后迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，常造成严重经济损失[2]，严重影响了养猪业的生产安全。1987年PRRS首先发现于美国，1991年，Wensvoort等首次利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）从中分离出了PRRS病原（Lelystad）[2]。中国于1996年由郭宝清等[3-6]首次从流产胎儿中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV），从而证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征，之后迅速蔓延至全国各地区[7-8]。为了解该病在新疆的流行现状，及PRRSV抗体依赖性和高变异性增强等特点，进一步丰富 PRRSV毒株基因组的信息数据，笔者对采自新疆乌鲁木齐七道湾地区的病料组织处理后经Marc-145细胞培养后得到的培养物进行毒力测定、RT-PCR鉴定及测序鉴定，得到新疆地方毒株，为进一步了解该病的流行现状及其生物学特性提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集在新疆乌鲁木齐市某养猪场无菌采集疑似猪蓝耳病死猪的肺脏、淋巴结等组织病料，-70 ℃保存备用。

1.1.2 细胞及血清 Marc-145细胞系，由畜牧科学院兽医研究所传染病实验室提供；胎牛血清（FBS）为生工生物产品。

1.1.3 主要试剂及试剂盒胰蛋白酶和青链霉素实验室保存，DMEM培养基、Trizol试剂为生工生物产品；TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病料处理青链霉素清洗病料数次，剪碎、研磨，加入适量的DMEM培养液将其稀释至1∶3，反复冻融3次，分装至1.5 mL无菌离心管中，3 000 r·min-1离心10 min后留上清液，0.22 μm过滤膜除菌，保留滤液为待分离病毒液，保存在-70 ℃备用。

1.2.2 细胞培养复苏Marc-145细胞：从液氮罐中取出细胞冻存管，瞬时放于37 ℃水浴恒温锅内，同时用镊子轻轻摇晃冻存管2 min将管内物质完全融化后，在生物安全柜内用移液器取出Marc-145细胞移入离心管中，加入无FBS DMEM至4.5 mL，1 000 r·min-1离心5 min。倒掉上清液，补加细胞生长液至7 mL，用吸管慢慢吹打混匀，移入培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞是否吹打散开，放入37 ℃的CO2培养箱中，左右摇晃，拧上培养瓶瓶盖（不可拧紧，稍有空隙，保证CO2能进入瓶内）。隔夜后，弃去旧培养液，用无FBS DMEM培养液洗1次瓶内细胞，再加入7 mL生长液（含10%胎牛血清FBS），酒精棉球擦拭瓶盖及培养瓶上半身，放入培养箱内，如此传至第3代进行病毒分离。

1.2.3 病毒分离将1.2.1处理后的病料上清液经0.22 μm过滤除菌，取1 mL过滤菌液接种于单层的Marc-145细胞，37 ℃温箱中吸附60～90 min，期间每30 min摇晃1次，使病毒液均匀接触细胞层，而后加入维持液（含2%胎牛血清）至7 mL，放于5% CO2 37 ℃培养箱培养3～5 d。盲传3代，观察细胞病变（CPE）。

1.2.4 病毒的电镜观察取致细胞病变的细胞培养物，反复冻融3次，1 000 r·min-1离心15 min，浓缩后加0.8%甲醛灭活，2%磷钨酸负染，透射电镜观察。

1.2.5 病毒TCID50滴定将长成单层的Marc-145细胞消化后移入96孔培养板内，每孔细胞单层生长大约80%密度，用于接种病毒，步骤如下。

待测病毒液稀释：将病毒液置于灭菌后的EP管中，采用维持液培养基进行10倍递增稀释，取10-3～10-7稀释度，每个稀释度5个孔，每孔加入病毒液100 μL，同时设置2列对照孔（用维持液代替病毒液）。置于37 ℃ 5% CO2培养箱中吸附1 h，之后弃去病毒液，用无血清的DMEM洗涤后，加入100 μL维持液培养48 h后逐日观察，直至第5天记录出现CPE的孔数，计算CPE比率。

按Reed-Muench两式法计算TCID50。

1.2.6 病毒RNA的提取及RT-PCR 病毒RNA的提取：取750 μL病毒液，按照生工生物公司Trizol剂盒的操作步骤提取病毒总RNA。

RT-PCR反应。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，利用自行设计的特异性引物，在PCR反应管中加以下溶液及试剂：RNA模板0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·（LdNTPs 2.5 μL）-1，引物（上、下游引物）1 μL，MgCl2 5 μL，RNase Inhibitor（4 μ·μL-1） 0.5 μL，AMVRTase 0.5 μL，AMV-Optimized Tap 0.5 μL，用无RNA酶水补足25 μL。PCR反应条件：预变性温度50 ℃，时间30 min；预变性94 ℃，时间2 min；变性温度94 ℃，时间30 s；退火温度56 ℃，时间30 s；延伸温度72 ℃，时间1 min，循环次数30；延伸温度72 ℃，时间10 min。

电泳：取PCR扩增产物5 μL用0.8%琼脂糖凝胶（含0.5 μg·mL-1EB）电泳，100 V电压40 min进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

2.2 病毒的电镜观察

2.3 PRRSV分离株TCID50测定结果

统计接种病毒的96孔细胞培养板，在5 d后出现CPE的情况，并用Reed-Muench法计算距离比得出TCID50结果为10-5·（100μL-1），即PRRSV分离株在Marc-145细胞上的增殖毒价为TCID50105·mL-1。

2.4 RT-PCR鉴定结果

琼脂糖凝胶电泳结果表明，利用RT-PCR方法扩增出大小与预计结果一致的片段434 bp（图3）。将测得的序列与Gen Bank 数据库中已知序列进行比对及相似性分析，结果表明，此分离病毒为PRRSV。

3 结论与讨论

细胞分离、鉴定时PRRSV是最常用、也是最准确的诊断方法之一。PRRSV分离主要使用低成本的传代细胞如Marc-145细胞、猪肺泡巨噬细胞PAM[2]、CL2621细胞[9]。根据PRRSV分离株不同细胞嗜性也不同[10-11]。PRRSV更偏爱在PAM上复制，且亲嗜性最高，但是PAM制备技术难度较大，CL2621细胞是专利细胞。目前对PRRSV既敏感又方便的细胞为Marc-145和从Marc-145中克隆出的HS2H细胞。有实验证明，PRRSV新疆分离株适宜在Marc-145细胞上生长[12]，并从中分离到病毒，故本研究采用Marc-145细胞进行PRRSV的分离培养，同时也证实了新疆地区分离株在Marc-145细胞上培养有很好的增殖并能产生典型的CPE。

对PRRSV的检测方法很多，包括血清中和试验（SN）、核酸探针杂交技术、间接免疫荧光抗体试验（IFA）、过氧化酶单层试验（IPMA）、胶体金抗体检测技术（GIA）、乳胶凝集试验（LAT）、RT-PCR及重组蛋白分子诊断技术[13-14]等。实验室检测方法有：病毒的分离（VI），间接免疫荧光（IFA），血清中和试验（SVN），ELISA，RT-PCR等。猪繁殖与呼吸综合征的检测方法众多，各有优点，其中病毒的分离、免疫荧光抗体染色法和免疫过氧化物酶染色法等均需细胞培养才行，因工作量大、周期长，故不利于在基层推广应用。而过氧化物酶单层试验需要大量猪肺泡巨噬细胞，同间接免疫荧光试验一样，在检测时会因为操作活毒而产生实验室安全隐患，并且过氧化物酶单层试验与间接免疫荧光试验不适合大范围检测，RT-PCR方法则相对快速、简便、特异性强。ELISA和IFA在众多检测PRRSV的方法中，步骤较为繁琐，不适合快速诊断，而RT-PCR可快速鉴别诊断PRRSV，故本试验采用RT-PCR方法进行分离病毒的检测。

本研究分离国内新疆毒株，选用Marc-145细胞进行分离培养，连续传代，盲传3代即产生明显的细胞病变。根据分离病毒毒株致Marc-145的CPE、毒价滴定、RT-PCR反应以及与GenBank上登陆的基因序列对比，证实所分离的病毒为PRRSV，与有关文献报道一致[15]，成功地从组织病料中分离得到猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将其命名为PRRSV新疆株（XJ-Q）。细胞出现CPE后取其感染物，从中提取RNA并通过PCR法鉴定，结果与预期相符，从而实现了对所获得分离培养物进行快速、确切的鉴定。成功分离获得的新疆分离株将为新疆PRRSV基因遗传变异分析的研究奠定基础。

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