分支DNA技术检测血浆游离DNA方法的建立及在急性心肌梗死患者中的初步应用

赵 丽，景蓉蓉，张鲁榕，俞荣华

循环游离 DNA(circulating free DNA，cf-DNA)是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在于血液(血清或血浆)、滑膜液和脑脊液等体液中。近来的研究表明在创伤、肿瘤、自身免疫性疾病和炎性反应等病理过程中可检测到cf-DNA的改变［1］。血液不同于其他体液，来源于全身各处，因而对血 cf-DNA含量进行准确定量具有重要意义。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者具有发病急、并发症多、病死率高等特点［2－3］。随着生物医学的进步，心脏的生物学标志物如肌钙蛋白 I(cTnI)、肌酸激酶同功酶 MB(CK-MB)和肌红蛋白(MYO)等已广泛应用于AMI的诊断。然而，现有的心脏生物学标志物也存在一定的缺点，如cTnI窗口期长而诊断再梗死以及判断梗死范围的能力差等。因此，人们仍在不断的探索特异性、敏感性及诊断价值更高的心脏生物学标志物。目前国内未见AMI患者血cf-DNA含量的相关报道。本研究拟采用分支 DNA(branched DNA，bDNA)信号放大的定量检测技术建立检测血中cf-DNA-ALU含量的方法，并对其进行方法学评价，初步应用于AMI患者的检测。

1 材料与方法

1.1 标本来源

实验组:2010年5月至2011年8月在南通大学附属医院就诊的82例AMI患者(年龄40～85岁，男性50例，女性32例)。符合美国心脏病学会/美国心脏协会2007诊断标准确诊为AMI。排除标准:1)既往有AMI史;2)合并慢性心功能不全、外伤、肿瘤、肺栓塞、中风、心肌病、肝脏疾病、肾脏疾病及免疫系统疾病;3)正在上述疾病治疗中。对照组:60名在南通大学附属医院体检中心的健康成人。本研究中，所有受试对象均匿名。本研究经南通市第四人民医院医学伦理委员会批准。对照组血液标本于清晨采血。AMI组于胸痛发作6 h内采血。均采集肘静脉血2 mL。将采集的肘静脉血2 mL，立即置于肝素抗凝管中，4 000 r/min离心5 min，取血浆置于离心管，－80℃冻存。所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

针对ALU基因的捕获辅助探针(capture extender，CE)、标记辅助探针(labeled extender，LE)和封闭探针(Blocking probe，BL)由美国罗切斯特大学放射肿瘤系张鲁榕教授提供。裂解液、含捕获探针的96孔板、前放大探针和放大探针、碱性磷酸酶标记探针(Panomics公司)。人类基因组DNA标准品(Promega公司)。cTnI、CK-MB和MYO检测试剂盒(上海蓝怡公司)。

1.3 bDNA技术检测血ALU基因含量的基本原理

将捕获探针固化在96孔板上，CE一端与靶序列结合，另一端与捕获探针结合;LE一端与靶序列结合，样本其余位点用BL封闭;LE的另一端接前放大探针，再接放大探针，每个放大探针上可接碱性磷酸酶标记探针。通过与底物反应，使得检测敏感性更高。

1.4 bDNA技术检测血ALU基因含量的步骤

血浆标本用双蒸水1∶20稀释后，置95℃加热5 min，冰水即刻冷却。取90μL探针工作液(裂解液、TE缓冲液、蛋白酶 K、BL、CE和 LE组成)和10μL DNA样本(样本、质控品双份测定，标准品3份测定)加入包被了捕获探针的96孔反应板。锡泊纸封闭微孔板，立即放入杂交炉55℃杂交1 h。每孔加入300μL洗涤液洗板3次后各孔加1∶1 000稀释的前放大探针100μL，55℃孵育30 min;同样洗板后，每孔加1∶1 000稀释的放大探针100μL，55℃孵育30 min和1∶1 000稀释的标记探针50℃孵育30 min。再次洗板后每孔加100μL底物工作液，室温下孵育5～10 min后，在发光仪读每孔吸光度(A)值，求每样本的平均值，以标准品浓度和A值绘制标准曲线，根据标准曲线计算每样本稀释后的ALU含量，将结果乘以20即得每样本的ALU的含量。

1.5 bDNA技术检测血ALU基因含量的方法学评价

将购买的人类基因组DNA标准品进行2倍系列稀释(浓度依次为 400、200、100、50、25、12.5、6.25和0 ng/mL)，以不同浓度的人类基因组DNA标准品为横坐标，以相应浓度标准品的吸光度为纵坐标，建立了检测ALU的标准曲线。

以浓度分别为20、100和200 ng/mL的DNA标准液，同一批重复做12个测定，计算批内CV值;连续测定12 d，以每个浓度12个测定结果计算批间CV值。

在ALU含量为50 ng/mL的样品中取0.9 mL溶液分别加入浓度为50、100、200和400 ng/mL的标准溶液0.1 mL进行回收实验。

1.6 统计学分析

用Sigmaplot 11.0软件进行统计分析。ALU含量用中位数(四分位区间)［M(P25～P75)］表示。AMI组和正常对照组 ALU含量比较用 Student's paired-sample t检验。批内、批间不精密度用变异系数(CV)表示。0.99，斜率=1779(图1)。以空白检测结果的均值加上3倍标准差为本方法的最低检测限，浓度为0.86 ng/mL。该方法的批内 CV为 7.85% ～11.75%，批间CV为10.05% ～14.32%(表1)。加入浓度50、100、200和400 ng/mL的标准溶液后回收率为106.01%、96.33%、104.03%和93.35%。

2.2 ALU在健康对照组和AMI组中的含量

用建立的 bDNA技术检测。82例 AMI患者ALU的含量(中位数4 223 ng/mL，四分位数区间2 285～7 864 ng/mL)远高于60例健康对照组者(中位数118 ng/mL，四分位数区间81～218 ng/mL)(P ＜0.0001)。

2.3 AMI患者ALU含量和心肌标志物的相关性分析

82例 AMI患者血浆 cTnI、CK-MB和 MYO与ALU表达量无相关性(图2)。

2.4 血浆ALU含量对AMI诊断效能的评价

本研究对AMI患者ALU含量结合健康对照组作ROC曲线，其曲线下的面积分别为0.99，敏感度98.8%，特异性100.0%，诊断界值631 ng/mL(图3)。

图1 bDNA技术检测ALU方法的线性Fig 1 The linearity of bDNA-based ALU assay

2 结果

2.1 bDNA技术检测血中ALU基因含量的方法学评价

标准品浓度在0～400 ng/mL内成线性，R2=

图2 血浆ALU含量与cTnI、CK-MB、MYO相关性分析Fig 2 Correlation of ALU with troponin I，CK-MB and MYO

表1 批内和批间变异Table 1 Intra-assay variation and Inter-assay variation(x ± s，n=12)

图3 ALU诊断急性心肌梗死的ROC曲线Fig 3 ROC curve for ALU in order to diagnose AMI

3 讨论

目前，国内外应用较多的是实时荧光定量PCR方法检测cf-DNA含量，但由于外周血中cf-DNA含量极其微弱，提取的DNA浓度和纯度总是达不到理想的效果而且费时、价格相对较高［4－5］。本研究选取ALU基因建立一种类似“酶联免疫吸附法”的检测手段-bDNA技术检测血cf-DNA的含量。ALU家族是灵长类基因组特有的含量丰富的中度重复序列，人类基因组全部基因的3/4都和ALU有关。bDNA技术不同于PCR技术，是一种杂交基础上的信号放大系统。选择ALU基因并结合bDNA技术可提高cf-DNA检测的敏感度［6］。本检测方法一个测试仅需要10μL血浆，极大简化操作步骤。

血cf-DNA的含量与AMI的关系如何?本研究中AMI组ALU含量远高于健康对照组，这与通过染料法定量 AMI患者血 cf-DNA的结果一致［7］。ROC分析显示血ALU的诊断敏感度和特异度显著高于血cTnI、CK-MB和MYO。这表明血中ALU的定量检测对AMI的辅助诊断有一定的价值。血cTnI、CK-MB和MYO是临床常用的心肌诊断标志物，但通过相关性分析未发现与血cf-DNA相关性，可能的原因是这些指标的生物半衰期不同，在发病的6 h内尚未达到最高峰。

总之，本研究应用bDNA技术定量检测血ALU的含量，具有灵敏、重复性好、线性范围宽等优点，并用该方法首次证实了AMI患者中ALU含量增加，但ALU能否作为AMI早期诊断指标以及与疾病进程的关系仍需扩大样本量并进行动态的观察研究。

［1］Jing R，Cui M，Wang H，et al．Cell-free DNA:Characteristics，Detection and its Applications in Myocardial Infarction［J］．Curr Pharm Des，2013，19:5135 －5145．

［2］王超，苗齐．miRNAs在心肌梗死和心力衰竭中的作用［J］．基础医学与临床，2013，33:508－511．

［3］栾云，刘晓程，张兆华，等．骨髓间充质干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死［J］．基础医学与临床，2011，31:1156－1158．

［4］ Papadopoulou E，Davilas E，Sotiriou V，et al．Cell-free DNA and RNA in plasma as a new molecular marker for prostate and breast cancer［J］．Ann N Y Acad Sci，2006，1075:235－243．

［5］Ehli EA，Lengyel-Nelson T，Hudziak JJ，et al．Using a commercially available DNA extraction kit to obtain high quality human genomic DNA suitable for PCR and genotyping from11-year-old saliva saturated cotton spit wads［J］．BMCRes Notes，2008，1:133．

［6］ Schmitz J．SINEs as driving forces in genome evolution［J］．Genome Dyn，2010，7:92－107．

［7］Chang CP，Chia RH，Wu TL，et al．Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction［J］．Clin Chim Acta，2003，327:95 －101．