阿托伐他汀下调大鼠心肌梗死后线粒体融合素2表达和细胞凋亡

周 炜，陈 玲，周 逸，陈曼华

心肌细胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因［1］。目前发现，他汀类药物可通过原癌基因Ras法尼基化的相关机制诱导磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositide 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路激活，发挥其调节细胞增殖和凋亡、心肌保护等调脂外作用［2－3］。线粒体融合素 2(mitofusin 2，Mfn2)是利用差异显示法从自发性高血压大鼠体内克隆获得的基因，其表达产物可负向调控PI3K/Akt信号通路，诱导细胞凋亡［4］。目前关于他汀类药物对Mfn2的调节作用尚不明确。因此，本实验建立大鼠急性心肌梗死模型，观察阿托伐他汀对心肌细胞凋亡及Mfn2表达的影响，进一步阐明其抗心肌细胞凋亡的机制，为其临床应用提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

凋亡检测(TUNEL)试剂盒(Roche公司);Mfn2抗体(Abcam 公司)，p-Akt抗体、Akt抗体、α-肌动蛋白(α-actin)抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗(Cell signaling公司)。免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色液(武汉博士德公司);阿托伐他汀(阿斯利康制药有限公司)。其他的试剂采用国产分析纯试剂。

1.2 实验分组

SPF级雄性SD大鼠48只，体质量(250±30)g(华中科技大学同济医学院实验动物中心)，动物许可证号:【SYXK(鄂)2009-0049】。实验分为假手术组(sham);心肌梗死组(myocardial infarction，MI);阿托伐他汀1组(statin 1);阿托伐他汀2组(statin 2)，共4组，每组12只。Statin 1组和statin2组术前7 d开始每日灌胃，给予阿托伐他汀10和40 mg/kg，剂量的选择参考文献［5］。Sham组及MI组予等量蒸馏水灌胃。

1.3 建立大鼠心肌梗死模型

参照文献［1］进行。腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，小动物呼吸机鼻面罩辅助通气。开胸后分离胸膜、心包，在左心耳下缘、肺动脉圆锥水平结扎左前降支。造模成功的标准为:1)心电图标准II导联ST段呈弓背向上型抬高，2)结扎动脉远端心肌出现苍白。假手术组开胸后于左前降支下穿线，不结扎。各组存活至术后24 h的动物数量分别为sham 组(12只)，MI组(9只)，statin 1组(10只)，statin 2组(10只)。处死大鼠后取心脏标本，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片。

1.4 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

按试剂盒操作说明染色，以细胞质染成棕黄色为阳性，每张切片在梗死边缘区域(假手术组在左室前壁)随机取5个高倍镜视野，记录阳性细胞数，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)，AI(%)=凋亡细胞质数/总细胞质数×100%，每张切片取5个视野求均值。

1.5 免疫组化法检测Mfn2蛋白表达

按试剂盒说明操作检测Mfn2蛋白表达。每张切片在梗死边缘区域(假手术组在左室前壁)随机选取5个高倍镜视野，虚拟显微镜拍摄图像，使用Image pro-Plus图像分析软件测定Mfn2蛋白表达平均吸光度值(mean absorbance)。

1.6 免疫印迹法检测p-Akt的表达

提取组织总蛋白，测定蛋白浓度。蛋白上样量为50μg，经电泳、转膜、封闭后，将膜在一抗(抗β-actin、抗p-Akt、抗Akt)中4℃孵育过夜。缓冲液洗脱后放入辣根过氧化物酶标记的二抗中室温孵育2 h后进行检测。Quantity One软件测定条带吸光度值，进行半定量分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组心肌细胞凋亡的分布

凋亡细胞质呈棕黄色，正常细胞质呈蓝色。Sham组心肌细胞未见明显凋亡;与MI组比较，阿托伐他汀1组、2组AI均显著下降(p＜0.05)，且阿托伐他汀2组较1组AI降低更显著(p＜0.05)(图1，表1)。

2.2 各组心肌组织Mfn2蛋白的表达

Sham组未见明显心肌梗死区域，Mfn2蛋白少量表达;与sham组比较，MI组在心肌梗死边缘区域Mfn2蛋白表达显著增加(p＜0.01);与MI组比较，阿托伐他汀1组和2组Mfn2表达显著降低(p＜0.05)，且阿托伐他汀2组较1组表达更低(p＜0.05)(图2，表1)。

图1 各组TUNEL染色结果Fig 1 Comparison of TUNEL staining results among 4 groups(×400)

表1 各组凋亡指数、p-Akt以及Mfn2吸光度值的比较Table 1 Comparison of the apoptosis index，the mean absorbance of p-Akt and Mfn2 among 4 groups，%，n=6)

表1 各组凋亡指数、p-Akt以及Mfn2吸光度值的比较Table 1 Comparison of the apoptosis index，the mean absorbance of p-Akt and Mfn2 among 4 groups，%，n=6)

*P ＜0.01 compared with sham;△P ＜0.05 compared with MI;#P ＜0.05 compared with statin 1．

group apoptosis index mean absorbance of Mfn2 mean absorbance of p-Akt sham 0.00±0.00 8.14±1.34 82.34±5.12 MI 61.32±6.37* 49.52±3.29* 9.57±0.19*statin 1 37.24±3.56＊△ 33.61±2.07＊△ 17.25±1.42＊△statin 2 24.49±3.14＊△# 24.18±1.93＊△# 25.31±2.55＊△#

图2 各组免疫组化染色结果Fig 2 Comparison of immunohistochemical staining results among 4 groups(×200)

2.3 各组心肌组织p-Akt的表达

与sham组比较，MI组心肌组织中p-Akt蛋白表达显著降低(p＜0.01);与MI组比较，阿托伐他汀1和2组p-Akt表达显著上升(p＜0.05)，且阿托伐他汀2组较1组表达更高(p＜0.05)(图3;表 1)。

3 讨论

心肌细胞凋亡是急性心肌梗死早期细胞丢失的重要形式，Ras-PI3K/Akt信号通路是促发心肌细胞凋亡的关键路径［6］。通过药物或基因治疗干预凋亡相关基因的表达，调控细胞内信号传导通路，抑制细胞凋亡，有可能成为防治心肌梗死的有效手段［7］。

图3 各组免疫印迹法检测结果Fig 3 Comparison of Western blot results among 4 groups

他汀类药物是广泛应用于临床的调脂药物，具有多重调脂以外的作用。研究发现，他汀类药物通过抑制甲羟戊酸合成，使其下游的焦磷酸法尼酯和焦磷酸牛儿基牛儿酯减少，阻碍小三磷酸鸟苷结合蛋白Ras、Rho、Rac等异戊二烯化，影响 Ras-PI3K/Akt及丝裂原活化的蛋白激酶信号通路，具有抗氧化应激及抗炎等调脂外作用［2－3，8］。本研究发现，术前7天开始每日给予阿托伐他汀可显著抑制大鼠急性心肌梗死后的细胞凋亡，且具有一定的剂量依赖性。

Mfn2是一种线粒体外膜蛋白，对线粒体形态及功能有重要的调节作用［4］。Mfn2也是细胞凋亡信号通路中一个新的调控点。该基因是原癌基因Ras的直接负调控因子，能够与其相互作用，阻滞Ras-PI3K/Akt信号通路，抑制 Akt磷酸化，进而减少BCL-2蛋白表达，增加Bax蛋白表达，通过线粒体途径诱导细胞凋亡［9］。本研究发现，大鼠发生急性心肌梗死后，局部组织Mfn2表达显著增高，p-Akt表达显著降低，表明Akt磷酸化受到抑制，提示缺血缺氧损伤激活了Mfn2的表达，从而促发心肌细胞凋亡增加。而阿托伐他汀干预则可显著下调Mfn2表达，进而促进Akt磷酸化，抑制心肌细胞凋亡，作用呈一定的剂量依赖性。

初步结果显示，Mfn2基因可能是大鼠心肌梗死过程中一个重要的促凋亡基因，参与阿托伐他汀抑制心肌梗死后细胞凋亡的过程，也是阿托伐他汀发挥其心肌保护作用的一个重要靶基因，其具体机制有待进一步研究。

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