ZFX在小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

苏文媚 武奋萍 罗亮 许贝 杨志雄 赖振南

广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 524000

小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一种以生长迅速、早期转移、高度侵袭性为特点的肺癌类型，其发病率约占原发性肺癌的15%～20%［1-2］。SCLC的肿瘤细胞对化疗和放疗都非常敏感，但几十年来多方案的临床试验并没能找到彻底治愈SCLC的有效方法，多数患者在一线治疗以后仍会复发或转移，临床预后 差［3-4］。X染色体耦联锌指蛋白(zinc finger protein X-linked，ZFX)是锌指蛋白家族中的一员，其含有13个C2H2的锌指结构。ZFX基因位于哺乳动物的X染色体上，其表达在哺乳动物中呈高度保守性，其结构包含一个酸性转录激活区、一个核定位序列及一个DNA结合位点［5］。早期研究认为ZFX基因与哺乳动物的性别决定有关，目前研究发现ZFX基因在多种类型的干细胞和肿瘤细胞中表达增高［6］，其与肿瘤的关系已经成为国内外普遍关注的热点。在肿瘤学研究中已经发现ZFX在前列腺癌、乳腺癌、白血病等人常见恶性肿瘤中出现异常表达［7-9］。然而关于ZFX在SCLC中的作用目前国内外尚未见相关 报道。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2008年1月—2013年8月在广东医学院附属医院肿瘤中心行手术切除或支气管镜活检的SCLC组织标本98例，选择资料完整的SCLC患者78例进行研究，其中男性36例，女性42例；患者年龄30～82岁，中位年龄53岁，53岁以下患者43例，53岁以上患者35例；广泛期43例，局限期35例；化疗敏感者(化疗5～6个周期后肿瘤完全缓解或部分缓解)35例，化疗耐药者(化疗5～6个周期后疾病稳定或进展者)43例，组织标本放入液氮冷冻后，用锡纸包裹，在研钵中充分研磨，研磨后用TRIzol反复洗涤研磨的碎末，用经DEPC水处理后的冻存管收集，放入液氮，用时提取RNA进行检测。所有患者术前均未行放化疗，临床资料完整，患者未并发其他系统疾病。所有患者均经过病理学检查确诊为SCLC，78例患者均接受EP方案化疗。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。全部78例患者出院后均随访，随访方式为电话和门诊随访，随访内容包括一般情况、临床症状和影像学检查。随访起点为病理确诊日期，末次随访时间为2013年8月31日，截止随访终止时，存活患者22例(21.74%)，死亡患者56例(78.26%)，无失访患者。

1.2 总RNA的提取及实时荧光定量PCR

按照试剂说明书，通过TRIzol提取试剂盒从SCLC组织标本中提取总RNA；测量总RNA浓度，取1 μg RNA按逆转录合成试剂盒说明合成cDNA，然后以该cDNA为模板，PCR仪中扩增从SCLC组织标本中提取的总RNA进行逆转录和实时荧光定量PCR。ZFX及内参照GAPDH的引物序列见表1。逆转录反应及PCR扩增参照试剂盒说明进行，以ZFX基因的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应在实时定量PCR反应仪上进行；3次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-∆∆Ct的方法进行分析。ΔΔCt=(待测样品的目的基因的Ct的平均值-待测样本的管家基因的Ct的平均值)－(对照样品的目的基因的Ct的平均值-对照样本的管家基因的Ct的平均值)。

表1 ZFX及内参照GAPDH的引物序列Tab. 1 The primer sequence of ZFX and GAPDH

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。ZFX在小细胞肺癌组织中的表达差异采取t检验进行分析，ZFX的表达与各临床病理参数之间的关系使用Chi-Square检验；采用Kaplan-Meier法分析ZFX的表达与生存期的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ZFX基因在SCLC组织中的表达

实时荧光定量PCR法检测ZFX基因在SCLC组织(SCLC局限期患者组织标本和广泛期组织标本)中的表达，结果提示ZFX基因在SCLC局限期组织标本中的表达水平较广泛期患者明显降低，差异有统计学意义(P<0.001，图1)。

图1 实时荧光定量PCR检测ZFX基因在SCLC局限期和广泛期组织标本中的差异表达Fig. 1 The differential expression of ZFX gene was presented in the limited stage tissues and extensive stage SCLC tissues by QRT-PCR

2.2 ZFX蛋白在SCLC组织中的表达及其与临床病理特征的关系

ZFX的表达与患者的性别无关，差异无统计学意义(χ2=0.179，P=0.672)。ZFX的表达与患者的年龄无关，差异无统计学意义(χ2=2.474，P=1.116)。ZFX在局限期患者中的表达较广泛期患者低，两者的ZFX表达率差异有统计学意义(χ2=20.539，P<0.001)。ZFX在化疗敏感患者中的表达较耐药患者低，差异有统计学意义(χ2=15.84，P<0.001)。ZFX在存活患者中的表达较死亡患者低，差异有统计学意义 (χ2=18.022，P<0.001，表2)。

2.3 SCLC患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估计患者生存时间，结果发现患者的生存时间与性别和年龄无相关性，差异无统计学意义(P>0.05)；疾病的分期、患者对化疗的敏感性及ZFX的表达与患者的生存时间相关。对化疗敏感者的生存时间长于耐药患者，差异有统计学意义(χ2=4.585，P=0.032，图2A)；局限期患者的生存时间长于广泛期患者，差异有统计学意义(χ2=9.921，P=0.002，图2B)；ZFX低表达患者的生存时间长于高表达患者，差异有统计学意义 (χ2=19.841，P=0.000，图2C)。

表2 ZFX的阳性表达与患者临床病理特征的关系Tab. 2 Association of ZFX with clinicopathological parameters

图2 Kaplan-Meier法估计患者生存时间Fig. 2 Survival times was evaluated by Kaplan-Meier assay

3 讨 论

肺癌是当今世界对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，我国肺癌发病率增长迅速，多数学者把更多的研究目光集中在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)治疗上，而SCLC的发病率却悄然增长，由于研究的关注度和力度明显不及前者，多年来治疗无明显突 破［10-11］。SCLC的治疗以全身化疗为主，联合放疗和手术为主要治疗手段。目前临床上化疗一般采取顺铂为基础的两药联合治疗方案，尽管SCLC患者对化疗敏感，但很快出现的多药耐药现象导致化疗失败，极易复发［12］。复发后对任何细胞毒药物均无作用。因此，如何克服SCLC的耐药性，成为临床上治疗SCLC及提高生活质量、延长生存时间的急需解决的重要 问题。

锌指蛋白是指含有短的稳定的能与Zn2+结合并自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质。由于其自身的结构特点，锌指蛋白可以选择性地结合特异的靶结构，在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作 用［13-14］。近年来Galan-Caridad等［15］报道ZFX是胚胎干细胞和成体干细胞自我更新的共同分子基础。Arenzana等［16］报道在B淋巴细胞中ZFX调控BCR介导的细胞增殖。研究者发现ZFX在胚胎干细胞和成体造血干细胞中高表达；ZFX基因敲除的胚胎干细胞和成体造血干细胞出现大量AnnexinⅤ阳性的凋亡细胞，而ZFX基因过表达的干细胞自我更新良好、生长迅速，且维持未分化状态。这表明ZFX蛋白在多种干细胞的自我更新和抗凋亡机制中起着重要作用。还有研究发现ZFX沉默并不影响Oct4、Sox2、Nanog等经典的干细胞自我更新通路［17］。然而关于ZFX蛋白在SCLC中的研究目前国内外尚未见相关报道。本研究通过发现ZFX基因在SCLC局限期组织标本中的表达较广泛期患者明显降低，且与患者的疾病分期、对化疗药物的敏感性及生存时间相关。然而影响SCLC临床预后的因素很多，本研究结果可能为基于ZFX研究SCLC治疗及预后的研究提供一定的理论基础和治疗靶点。

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