大孔树脂纯化甘草地上部分总黄酮的工艺

韩亚男,程新宇,侯俊玲,3＊,王文全,2,3,郑巧云

(1.北京中医药大学中药学院,北京100102;2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京100193;3.中药材规范化生产教育部工程研究中心,北京100102)

甘草地上部分是甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的茎和叶。甘草地上部分的主要化学成分为黄酮类物质,盛花期甘草叶中总黄酮含量可达到5.64%[1]。研究[2-5]证明,甘草地上部分总黄酮具有和甘草根中总黄酮相类似的抗肿瘤、抗炎和抑制胃酸分泌过多等药理作用,具有很大的开发潜力。但由于甘草地上部分含有大量的多糖、叶绿素和树脂胶等杂质,致使甘草地上部分提取液中总黄酮的纯度不高,影响进一步开发。目前关于甘草地上部分总黄酮的提取工艺已有人研究,但是其纯化方法尚未见报道。大孔树脂法是纯化黄酮等活性成分的简易、高效的方法[6-7]。本实验使用大孔树脂,优选了一套甘草地上部分总黄酮的纯化工艺,为后续研究提供基础。

1 实验材料

RE-Ⅱ旋蒸(上海亚荣生化仪器厂),SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科贸有限公司),pH100型笔试pH计(上海三信仪表厂),JBQ-100恒温摇床(常州普天仪器制造有限公司),SP-752型紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司),CP224C电子天平(奥豪斯仪器有限公司),PHS-2C型数字pH酸度计(上海精密科学仪器厂)。

甘草地上部分于2012年采于内蒙古杭锦旗,经北京中医药大学王文全教授鉴定,为甘草GLycyrrhiza uraLensis Fisch.的地上部分。芦丁对照品(批号:120927,纯度>98%,上海融禾医药科技有限公司),大孔树脂购于河北沧州宝恩化工有限公司,其他试剂均为国产分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 样品液的制备 秤取切制成4 cm小段的甘草地上部分20 kg,70%乙醇回流提取,95℃,2 h/次,3次。提取液浓缩至无醇味,取上清液备用。

2.2 测定方法[8-10]

2.2.1 标准溶液的配制 精密称取芦丁标准品20 mg,用50%乙醇定容至100 mL容量瓶中,摇匀即得(每毫升溶液中含芦丁0.2 mg)。

2.2.2 标准曲线的制作 精密吸取芦丁标准溶液0,0.5,1.0,1.2,1.4,1.5,1.6,1.8,2.2,2.6,3.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,各加50%乙醇至2 mL;加入5%NaNO2溶液 0.5 mL,混匀,放置 6 min;加入 10%Al(NO3)3溶液 0.5 mL,混匀,放置 6 min;加入 4%NaOH溶液5 mL,再加水至 10 mL,摇匀,放置15 min。以不加芦丁标准品的试剂空白作为参比溶液。用1 cm比色皿,在500 nm波长处测定吸光度,绘制标准曲线。以吸光度A为横坐标,芦丁质量浓度为纵坐标,得回归方程Y=0.079X+0.001,R2=0.999,线性范围1～60 mg/mL。

2.2.3 样品的测定 按照标准曲线制定的方法进行样品的测定。

2.3 大孔树脂型号静态筛选

2.3.1 大孔树脂静态吸附率的测定 精密秤取预处理好的6种大孔树脂各10 g(滤纸吸干树脂表面的水分)至50 mL具塞锥形瓶中,分别加入上清液溶液30mL(总黄酮浓度为2.03 mg/mL),置于摇床上使其充分吸附(37℃,80 r/min),10 h后分别测定各锥形瓶上清液中的总黄酮浓度,计算各型号树脂的静态吸附率。

静态吸附率=(吸附前总黄酮质量浓度-吸附后总黄酮质量浓度)/吸附前总黄酮质量浓度×100%

2.3.2 大孔树脂静态解吸附率的测定 将上述吸附饱和的树脂用滤纸吸干树脂表面残留的溶液,置于锥形瓶中,准确加入70%乙醇30 mL,置于恒温摇床中(37℃ ,80 r/min),振摇10 h,充分洗脱,过滤,得滤液,测定总黄酮含量,计算各大孔吸附树脂的静态解吸附率。

静态解吸附率=解吸附后总黄酮质量浓度/(吸附前总黄酮质量浓度-吸附后总黄酮质量浓度)×100%

2.3.3 大孔树脂静态富集总黄酮的回收率 甘草地上部分总黄酮经过大孔树脂吸附和解吸附的过程,过程中都有总黄酮损失,以总黄酮回收率能全面的反应大孔树脂的吸附性能。

静态富集总黄酮回收率=静态吸附率×静态解吸附率

实验比较了6种不同型号大孔树脂对甘草地上部分总黄酮的吸附性能,结果见表1。

表1 不同型号大孔树脂对总黄酮的吸附性能(±s,n=3)

表1 不同型号大孔树脂对总黄酮的吸附性能(±s,n=3)

树脂型号 吸附后质量浓度/(mg/mL) 吸附率/% 洗脱液质量浓度/(mg/mL) 解吸附率/% 总黄酮回收率/%HPD-BJQH 0.29±0.03 85.93 1.57±0.04 89.77 77.14 HPD-450 0.34±0.07 83.25 1.56±0.04 92.23 76.78 AB-8 0.26±0.07 87.11 1.56±0.02 88.33 76.94 HPD-417 0.43±0.07 78.64 1.39±0.04 87.05 68.46 DM130 0.28±0.09 86.43 1.57±0.05 89.39 77.27 HPD-600 0.25±0.07 87.72 1.51±0.08 74.42 65.28

由表1可知,树脂HPD-600和AB-8这2种树脂的吸附率较高,HPD-450和HPD-BJQH这2种树脂的解吸附率较高,但综合比较6种树脂的总黄酮回收率,DM130、HPD-BJQH这2种型号树脂对甘草地上总黄酮表现出较好的吸附性能,选择这2种型号树脂进行动态吸附性能考察。

2.4 大孔树脂型号动态筛选

2.4.1 泄露曲线的绘制 精密秤取DM130和HPDBJQH树脂各5 g(用滤纸吸干其表面水分),湿法装柱(内径为 1 cm,1 BV=8.7 mL)。上样液浓度为2.42 mg/mL,上样流速为1 mL/min,流出液每10 mL为一个单位,绘制泄露曲线。见图1。

2.4.2 动态洗脱 树脂饱和后静置过夜,充分吸附;4 BV水除杂,70%乙醇洗脱至洗脱液无颜色;收集洗脱液,70%乙醇定容至50 mL,测定洗脱液中总黄酮的浓度。

由图1可知,DM130树脂在上样量达到50 mL时,开始出现大量的黄酮泄露,在上样量为120 mL时,树脂基本吸附饱和。HPD-BJQH树脂在上样量达到80 mL时,黄酮开始大量泄露,在上样量为170 mL时,树脂吸附饱和,流出液总黄酮浓度和上样液总黄酮浓度很相近。通过UV测定二者洗脱液总黄酮浓度得知,DM130洗脱液中的总黄酮质量为187.75 mg;HPD-BJQH洗脱液中的总黄酮质量为231.99 mg。

图1 DM130和HPD-BJQH树脂的黄酮泄露曲线

结合树脂静态吸附性能,综合考虑,确定树脂型号为HPD-BJQH。根据泄露曲线显示,上样浓度为2.42 mg/mL时,5 g树脂上样总黄酮量为193.6 mg较合适。

2.5 大孔树脂工艺的正交试验优化

2.5.1 正交实验表的选用 固定每份树脂的装柱量,湿法装柱,根据影响大孔树脂吸附性能的因素采用L16(45),选择上样浓度、上样液pH值、上样速度和洗脱溶剂为考察因素,每个因素选取4个水平,以总黄酮的回收率为指标,对大孔树脂纯化总黄酮工艺进行优选。因素水平见表2。

2.5.2 正交试验及结果分析 取甘草地上部分提取浓缩液分别稀释15倍(2.93mg/mL),20倍(2.15 mg/mL),25倍(1.86 mg/mL),40倍(1.15 mg/mL),各180,240,300,480 mL,均分为 4份。按L16(45)正交表实验,将样品溶液上样到含有等质量树脂(4 g)的相同规格的树脂柱上(内径为 1 cm,径高比为1∶8,BV=7 mL)。上样完成后过夜充分吸附,4 BV水,流速4 BV/h除杂,见表3。按照上述正交试验表进行洗脱,洗脱速度为2 BV/h,体积为5 BV。收集洗脱液,50%乙醇定容至50 mL,测定洗脱液中的总黄酮含量,计算总黄酮回收率。

表2 大孔树脂纯化总黄酮因素表

总黄酮回收率=洗脱液中的总黄酮质量/上样液中的总黄酮质量×100%

通过实验结果的极差分析,可以看出,对结果影响的大小程度为:洗脱浓度>上样浓度>上样pH>上样速度>洗脱速度。甘草地上总黄酮纯化工艺最佳组合为A2B2C2D3,即上样浓度为2.15 mg/mL,上样速度为3 BV/h,pH值为5;70%乙醇洗脱。方差分析显示上样浓度,上样速度,上样液pH值以及洗脱液浓度均对结果有显著影响。

2.6 洗脱剂用量的考察 秤取HPD-BJQH树脂4 g,湿法装柱,按照正交试验考察的最优工艺进行上样,上样完成后,静置2 h,充分吸附,然后用70%乙醇,2 BV/h洗脱,每1/2 BV(3.5mL)为一单位收集洗脱液,测定其中的总黄酮浓度,绘制动态洗脱曲线。见图2。

表3 L16(45)正交实验结果

图2 HPD-BJQH树脂的动态洗脱曲线

表4 纯化前后总黄酮的纯度

由图2可知,当洗脱液用量为3 BV时,大部分黄酮被洗出,故洗脱体积定为3 BV。

2.7 验证试验 秤取HPD-BJQH树脂4 g,3份,湿法装柱,按照上述优化条件纯化甘草地上部分的总黄酮,收集所有洗脱液,蒸干,得总黄酮浸膏。精密秤取一定质量浸膏,50%乙醇定容至50 mL,测定溶液中总黄酮的浓度,计算纯化总黄酮的纯度,结果见表4。

3 讨论

本实验针对甘草地上总黄酮首次进行了富集纯化工艺的研究。针对黄酮类成分,笔者选择了具有代表性的极性(HPD-600)、中极性(HPD-450)、弱极性(AB-8、DM130、HPD-BJQH)以及氢键吸附(HPD-417)性质的大孔树脂进行型号筛选,全面考察了不同类别大孔树脂对甘草地上部分的适用性,试验结果稳定可信。

孔树脂富集纯化黄酮分为吸附和洗脱2个步骤,本实验以最后总黄酮回收率为考察指标,把影响富集纯化效果的所有条件都放在一个正交试验中进行优化。避免了单因素考察产生的误差,使试验具有整体性和严谨性。经过本工艺纯化后的总黄酮纯度由原来的9.68%提升到36.11%,验证试验证明,该工艺稳定,重现性好,能较好的纯化甘草地上部分总黄酮。随着甘草地上部分的进一步开发,该工艺可以应用到工业生产上。

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