改良混合脱钙液在骨髓活检组织中的应用

黄蓉飞，江 亮，龙小艺，张国宾

成都医学院第一附属医院 病理科（成都 610500）

骨髓活检是病理检查重要的组成部分之一，骨髓活检诊断报告又是血液科等临床科室疾病诊疗的重要依据。骨组织在骨髓活检组织中常见，其质地坚硬，如不能有效去除其中的钙质，病理技术室很难制作出优质切片或无法制作切片，组织标本脱钙处理即成为此类切片制作的关键［1］。如何在较短时间内完成标本固定、脱钙处理，同时制成的切片又能与常规处理的不含骨组织切片一样，不影响切片的染色，还能保证组织抗原不丢失，免疫组化染色效果好，从而有助于病理医师对病变组织的镜下诊断，一直是病理技术中探讨的热点之一。本文旨在探讨改良混合脱钙液在临床骨髓穿刺组织活检中的应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例收集 收集我院2014年6－12月使用改良混合脱钙液脱钙的骨髓穿刺活检标本146例（改良混合脱钙液组），同时查阅我院2008年使用传统硝酸类脱钙液（5%硝酸脱钙液）脱钙的骨髓穿刺活检标本42例（硝酸类脱钙液组）。

1.1.2 仪器 脱水机、包埋机、切片机、染色机和全自动免疫组化染色机。

1.1.3 脱钙液的配制 改良混合脱钙液配制：1）将30mL甲酸加入70mL 10%中性甲醛中，充分混匀；2）将30mL盐酸加入70mL 10%中性甲醛中，充分混匀；3）将以上两种液体混匀即可。5%硝酸脱钙液配制：将5mL浓硝酸加入95mL的蒸馏水中，摇匀即可。

1.2 方法

1.2.1 组织处理及染色 选择骨髓穿刺标本（长1cm，直径0.3～0.5cm）共188例，分为改良混合脱钙液组（146例）和硝酸类脱钙液组（42例），将标本放入10mL洁净的玻璃西林瓶内，用10%中性缓冲甲醛液固定240min，倾去固定液。改良混合脱钙液组加入适量的改良混合脱钙液，脱钙（120±60）min后取出，用蒸馏水冲洗。硝酸类脱钙液组采用5%硝酸脱钙液脱钙（240±60）min后用蒸馏水冲洗。两组标本同时常规脱水，石蜡包埋，连续切片3张，厚2μm，分别行HE染色，疑似肿瘤病例加做免疫组织化学染色（MPO、CD3、CD20等），免疫组织化学染色采用迈新MaxVisionTM试剂盒，枸橼酸或EDTA修复，DAB显色，苏木精复染细胞核，中性树胶封固，光镜观察。所有染色均用已知阳性片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.2 脱钙完成的判定 室温下进行脱钙，以大头针刺入组织，无阻力感为脱钙完成。

1.2.3 切片质量评价标准 切片外观完整，厚薄均匀，镜下组织结构完整，无刀痕，可判定为质量良好；达不到以上标准则视为质量欠佳。

1.2.4 HE染色效果判断标准 细胞核质清晰，细胞浆颜色鲜亮，对比明显，可判定为效果良好，达不到以上标准则视为效果欠佳。

1.2.5 免疫组化标记评价标准 阳性部位定位准确，表达良好，呈棕褐色，与阳性对照表达一致，可判定为良好；阳性部位定位不准确，部分抗原丢失，判定为欠佳。

1.2.6 制片效果满意度 由4位病理医师一致满意为满意，1位或以上病理医师不满意则为不满意。

1.3 统计学方法

采用χ2检验计算器V1.70进行统计学检验，计数资料采用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规HE切片结果

改良混合脱钙液组镜下：骨组织结构保持良好，骨髓细胞核呈蓝紫色，胞浆、红细胞呈红色，骨小梁呈淡红色（图1A）。硝酸类脱钙液组镜下：骨组织结构不清，胞核、胞浆对比不鲜明，模糊不清，均质红染（图1B）。改良混合脱钙液组中，3例切片制片不完整（完整率97.9%），2例染色效果稍欠佳（染色清晰率98.6%）；硝酸类脱钙液组中，16例切片制片不完整（完整率61.9%），19例染色效果不佳（染色清晰率54.8%）（表1）。

图1 两组脱钙液脱钙组织制片质量观察图

表1 两组脱钙液脱钙组织制片情况对比［n（%）］

2.2 免疫组化标记结果

经改良混合脱钙液脱钙的组织标本免疫组化染色阳性部位定位准确，表达良好，呈棕褐色（图2A）；5%硝酸脱钙液阳性部位定位不准确，部分抗原丢失（图2B）。

图2 两组脱钙液脱钙后免疫组化效果图

2.3 制片效果满意度

改良混合脱钙液组为满意，硝酸类脱钙液组为不满意。

3 讨论

由于骨髓组织富含钙盐，纤维支架少，组织具有细小、硬脆和疏松的特点［2］，不利于制片，故骨髓活检标本均需常规脱钙处理。病理组织脱钙是基于低浓度酸液与组织钙盐的化学作用（复分解反应），生成可溶于水的物质，从而去除组织钙盐。传统的病理组织脱钙液主要分为硝酸类、盐酸类、甲酸类、硫酸类、三氯醋酸类、螯合剂类等［3］。大多数病理科采用的常规病理组织脱钙液为硝酸类脱钙液，此类脱钙液脱钙时间和浓度不易掌控，脱钙效果不稳定，时常会出现脱钙不足或骨组织过度脱钙的情况［4］。脱钙不足会导致切片破碎，出现刀痕，甚至切不成片且极易脱片；脱钙过度则会导致组织结构及细胞成分的破坏［5］，且硝酸类脱钙液对组织内的酶、抗原、核酸均有一定的损害［6］，在组织脱钙过程中造成组织酸化，引起细胞核不着色或着色很浅，染色效果不理想，从而影响镜下对病变组织的病理学诊断［7］。组织脱钙是骨髓活检制片中的关键环节，选择一种有效便捷的脱钙方法对骨髓组织相关疾病的病理诊断至关重要［8］。

本研究通过对188例骨髓活检标本脱钙处理的对比分析发现，改良混合脱钙液脱钙时间、脱钙后的切片质量、染色效果及免疫组化染色均明显优于5%硝酸脱钙液脱钙的结果，与杨红［9］报道相近，制片效果满意度也得到病理医师的一致认同。本研究中改良混合脱钙液由30%浓度的甲酸、30%浓度的盐酸及10%中性甲醛组成（酸的浓度配比选择基于笔者在临床工作中对不同浓度的混合酸脱钙液的使用经验，总结出的最能满足临床骨髓穿刺组织活检脱钙时间要求，同时又最易制备出优质切片，并可取得良好染色效果的一种配比浓度）。脱钙液中的甲酸脱钙温和、不损伤组织，为减少甲酸脱钙速度缓慢的不足，加入适量盐酸，既加快脱钙速度，又防止纤维组织过度膨胀，减少组织破坏及对染色的影响［9－10］。加入中性甲醛能在脱钙同时增加骨髓组织的固定时间，使其充分固定，缩短骨髓组织脱水前处理的时间。改良混合脱钙液优点为：1）组织不变小、变腐，不会过度膨胀；2）固定与组织脱钙同时进行，速度较快，满足临床工作需要；3）脱钙时间易于控制；4）细胞核、细胞浆染色不受影响；5）不丢失抗原，不影响免疫组织化学染色；6）配方简单，易于掌握；7）脱钙液可反复使用，节约成本，简便快捷。需要注意的是：骨髓组织脱钙前宜先进行固定处理，处理时间最好≥4h，这样能更好地保护组织抗原和超微结构，利于疑似肿瘤病例后续的免疫组化染色中抗原表型的表达。

综上所述，改良混合脱钙液在骨髓组织脱钙处理中优点明显，在临床骨髓穿刺活检中具有重要作用，值得临床广泛推广。

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