抗层黏连蛋白γ1类天疱疮一例研究

李志量 张晓东 陈浩 刘沐桑 靳培英 冯素英 王宝玺

抗层黏连蛋白γ1类天疱疮一例研究

李志量 张晓东 陈浩 刘沐桑 靳培英 冯素英 王宝玺

患者男,55岁。临床表现为四肢、躯干紧张性大疱,组织学表现为表皮下水疱,真皮浅层有淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等浸润,初步诊断为大疱性类天疱疮(BP)。在血清学分析中,发现该患者血清中自身抗体与盐裂皮肤真皮侧结合,且酶联免疫吸附法未检测到BP180、BP230、Ⅶ型胶原抗体,从而排除了大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症的诊断。通过免疫印迹、免疫沉淀检测,发现该患者血清存在与真皮侧200 000蛋白结合的抗体,综合这些特点,诊断该患者为抗P200类天疱疮,即抗层黏连蛋白γ1类天疱疮。

抗层黏连蛋白γ1类天疱疮;抗P200类天疱疮;印迹法,蛋白质

抗层黏连蛋白γ1类天疱疮(anti-laminin γ1 pemphigoid)是一种罕见的自身免疫性水疱病,免疫学特点与以往已知的表皮下水疱病,如大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid,BP)、获得性大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa acquisita,EBA)、瘢痕性类天疱疮(cicatricial pemphigoid,CP)等有一定区别。该病患者血清中循环抗体与真皮侧提取物的200 000蛋白结合,后来该蛋白被证实为层黏连蛋白γ1,是一种细胞外基质蛋白,为多种层黏连蛋白三聚体的组成成分。

病历资料

患者男,55岁,入院前1个月无明显诱因口腔及周围出现红斑,面积逐渐扩大,在红斑基础上出现水疱,疱液澄清,疱壁紧张,自觉瘙痒,在当地医院诊断为大疱性类天疱疮,给予甲泼尼龙40 mg每日1次静脉滴注共3 d,控制不佳,躯干、四肢、头皮也出现多个水疱、大疱,自觉发热、乏力。来我院就诊时,体检见背部散在红斑、糜烂面,部分皮疹表面结痂(图1a)。四肢散在疱壁紧张的水疱(图1b),尼氏征(-)。在我院行组织病理学检查提示表皮下水疱,真皮浅层及血管周围见淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润(图1c)。直接免疫荧光检查示基底膜带IgG和C3呈线状沉积,初步诊断大疱性类天疱疮。入院后给予静脉注射免疫球蛋白400 mg·kg-1·d-1,甲泼尼龙80 mg/d共10 d,环磷酰胺0.6 g(仅用1次),无法控制水疱形成;将甲泼尼龙增至300 mg/d,静脉滴注5 d,新发水疱仍未得到控制;随后停用甲泼尼龙,改为地塞米松15 mg/d,加用麦考酚酯2 g/d,皮损逐渐控制。在随后的地塞米松减量过程中,皮损曾出现短暂的反复,经过1个月的维持治疗,水疱逐渐干涸结痂。

材料与方法

1.主要实验材料:正常人皮肤取自皮肤外科整形手术后残留皮瓣。实验中涉及到的主要化学试剂和试剂盒包括:鼠抗人层黏连蛋白γ1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),鼠抗人Ⅶ型胶原抗体(美国Sigma公司)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、山羊抗人IgG抗体(上海碧云天生物技术研究所),异硫氰酸荧光素标记山羊抗人IgG、IgA、IgM、C3抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),10%Bis-tris预制胶、MOPS电泳缓冲液、上样缓冲液,蛋白预染标准参照物,化学发光液,Classic IP试剂盒(美国Thermo公司),桥粒芯蛋白 Dsg1、Dsg3、BP180 NC16A、BP230、Ⅶ型胶原抗体检测试剂盒(日本MBL公司)。

2.盐裂间接免疫荧光(SSIIF):利用盐裂皮肤为底物,按常规间接免疫荧光步骤进行,使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 50i)观察。

3.真表皮抗原制备:分别用表皮抗原提取液(65 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L乙二胺四乙酸, 50 mmol/L二硫苏糖醇,2%十二烷基硫酸钠,pH6.8)和真皮抗原提取液(65 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L乙二胺四乙酸,100 mmol/L二硫苏糖醇,2%十二烷基硫酸钠,8 mol/L尿素,pH6.8)提取表皮、真皮蛋白,储存于-70℃备用。

4.免疫印迹:将真、表皮蛋白分别与4×上样缓冲液预混,加热变性后上样,200 V电泳45 min。转至PVDF膜,湿法转印,300 mA恒流2 h,BSA室温摇床振荡封闭1 h。分别与抗层黏连蛋白γ1单抗(1∶200稀释)、患者血清(1∶50稀释)在4℃摇床振荡孵育16 h,TBST洗涤后,加入相应二抗室温孵育1 h。TBST洗去未结合的二抗,采用化学发光法在凝胶成像仪 (Bio-rad ChemiDocTMXRS+)上观察各自条带。

5.酶联免疫吸附测定(ELISA):严格按照试剂盒说明书操作,用酶标仪(BioTek Synergyht)读取吸光度值,按照说明书提供的公式计算血清抗体滴度值。

6.免疫沉淀:使用商品化的免疫沉淀试剂盒(Classic IP试剂盒，Thermo Scientific 26146),利用抗层黏连蛋白γ1单抗沉淀出真皮侧蛋白,然后按免疫印迹步骤将蛋白上样,电泳转膜后与血清(1∶50稀释)孵育;用Ⅶ型胶原抗体和EBA患者血清作对照。

结果

盐裂间接免疫荧光示患者血清中IgG与盐裂皮肤真皮侧蛋白结合(图1d),IgA、IgM阴性。3次免疫印迹结果均发现患者血清抗体与表皮侧蛋白不反应,与真皮侧蛋白结合于200 000处,层黏连蛋白γ1单克隆抗体与真皮侧蛋白结合于200 000处,1例EBA患者血清抗体与290 000处蛋白结合(图2)。应用商品化ELISA试剂盒,患者血清中Dsg1、Dsg3、BP180、BP230、Ⅶ型胶原抗体均为阴性。免疫沉淀实验中,分别用抗层黏连蛋白γ1单抗和Ⅶ型胶原抗体沉淀真皮侧蛋白,然后分别与患者、EBA患者和正常对照血清结合,发现患者血清可以与层黏连蛋白γ1抗体沉淀出的蛋白反应,结合于200 000处,而EBA患者和正常对照血清与该蛋白不反应,EBA患者血清可以与Ⅶ型胶原抗体沉淀出的蛋白反应,结合于290 000处,患者血清与该蛋白不反应(图3)。综合以上实验结果,该患者最后诊断为抗层黏连蛋白γ1类天疱疮。

讨论

图1 患者病历资料 1a:背部见红斑糜烂面,部分皮疹结痂;1b:手背侧见疱壁紧张的水疱;1c:皮损组织病理:表皮下水疱形成,真皮浅层见淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润(HE×200);1d:盐裂皮肤间接免疫荧光示IgG抗体沉积在真皮侧

图2 免疫印迹结果 1:患者血清与表皮侧蛋白不反应;2:BP患者血清与表皮侧蛋白沉积于180 000、230 000处;3:抗层黏连蛋白γ1抗体结合于真皮侧蛋白200 000处;4:患者血清与真皮侧200 000蛋白结合;5:EBA患者血清与真皮侧290 000蛋白结合;6:正常对照、血清与真皮侧蛋白不反应;7:BP患者血清与真皮侧蛋白不反应

图3 免疫沉淀检测结果 1:患者血清与层黏连蛋白γ1单抗沉淀蛋白结合于200 000处;2、3:EBA患者、正常对照血清与层黏连蛋白γ1单抗沉淀蛋白不反应;4:EBA患者血清与Ⅶ型胶原抗体沉淀蛋白结合于290 000处;5:患者血清与Ⅶ型胶原抗体沉淀蛋白不反应

1996年,Chen等[1]报道了1例银屑病患者同时伴发表皮下水疱病,该病患者血清中存在针对真皮侧200 000蛋白的抗体。同年,Zillikens等[2]报道了1例不伴银屑病的表皮下水疱病,该患者血清中也存在针对真皮侧200 000蛋白的抗体。这两例患者有着共同的特点:临床表现均与BP相似,病理表现为真皮中性粒细胞为主的浸润,直接免疫荧光见IgG、C3在基底膜带呈线状沉积;SSIIF示血清抗体结合于盐裂皮肤的真皮侧;电镜观察到免疫复合物沉积于透明板的下层;免疫印迹显示血清抗体与真皮侧200 000蛋白结合。综合这些特点,这两例与常见的表皮下水疱病,如BP、EBA、CP等有明显区别,是一个新病种,命名为抗P200类天疱疮。此后,很多研究试图揭示抗P200类天疱疮患者血清中抗体所针对的靶抗原,这些可能的靶抗原包括层黏连蛋白β1[3]、巢蛋白[4]、Ⅵ型胶原的α链、细丝蛋白A[5]、Ⅶ型胶原降解产物[6]等,尽管这些蛋白位于真皮侧,且相对分子质量接近200 000,但证实这些蛋白与P200抗血清均无相关性。直到2009年,Dainichi等[7]通过2D电泳、质谱分析将这200 000抗原确定为层黏连蛋白γ1,此后该病即被命名为抗层黏连蛋白γ1类天疱疮。

BP和EBA患者血清中自身抗体会识别一个特定表位,如BP血清识别BP180 NC16A[8],EBA血清识别Ⅶ型胶原NC1段[9],且识别这一特定表位的抗体具有致病性,可以通过针对这一表位的抗体构建相应的动物模型。但抗层黏连蛋白γ1类天疱疮却很特殊;90%抗层黏连蛋白γ1类天疱疮患者血清自身抗体可以与层黏连蛋白γ1羧基末端的246个氨基酸段(hLAMC1-cterm)结合[7],但纯化的患者血清中针对该肽段的抗体却没有致病性[10];用该肽段免疫兔产生的多克隆抗体也未能成功构建该病的动物模型[11]。在Florea等[12]的研究中,针对层黏连蛋白γ1氨基端的抗体可以干扰层黏连蛋白γ1与巢蛋白的结合,并能激活补体、诱导粒细胞活性氧释放、引起真表皮分离,提示针对氨基段的抗体有致病性,但7例中仅1例患者血清中存在针对层黏连蛋白γ1氨基端的抗体,这种识别表位与致病表位的“分离”现象尚待进一步研究。

综合国外报道的该病病例,可总结如下特点:该病发病年龄多为50～70岁,近半数伴有银屑病。患者可以出现紧张性水疱和荨麻疹样发疹,伴有瘙痒,临床表现与大疱性类天疱疮难以鉴别。其病理表现为真皮中性粒细胞浸润,也可形成微脓肿,也有部分患者可见嗜酸性粒细胞浸润[13]。本例患者临床表现、病理学检查及直接免疫荧光检查均符合BP。但SSIIF检查发现患者血清抗体沉积于盐裂皮肤真皮侧,且ELISA法无法检测到BP180 NC16A、BP230抗体,因此可排除大疱性类天疱疮的诊断。目前常见的血清抗体沉积于盐裂皮肤真皮侧的大疱病主要是EBA和CP,EBA患者血清应与真皮290 000蛋白结合,而该患者免疫印迹结果与之不符,且用ELISA法也未能检测到Ⅶ型胶原抗体,故排除EBA的诊断。CP患者循环抗体可结合于表皮侧,抗层黏连蛋白5 CP患者的IgG循环抗体结合在真皮侧,层黏连蛋白5的3个亚基laminin α3、β3、γ2的相对分子质量均不是200 000,且CP患者突出表现为黏膜受损,这些特点均与本例不符。该患者重复3次免疫印迹检查均发现血清抗体结合于真皮侧200 000蛋白处。查阅国内外文献,血清抗体与真皮侧200 000蛋白结合的表皮下大疱病只有抗层黏连蛋白γ1类天疱疮,结合该例患者SSIIF及ELISA结果,我们认为本例患者应该诊断为抗层黏连蛋白γ1类天疱疮。

但我们的研究也有不足之处,在既往国外文献报道过的该病患者中,病情大多较轻,少数患者不经治疗可以自愈,且组织学表现以中性粒细胞浸润为主,嗜酸性粒细胞较少;而本例患者病情相对较重,初期对治疗抵抗,病理学检查并未发现明显的中性粒细胞浸润;这些现象的原因尚待进一步阐明。

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2014-01-09)

(本文编辑:吴晓初)

Anti-laminin γ1 pemphigoid:a case report

Li Zhiliang，Zhang Xiaodong，Chen Hao，Liu Musang，Jin Peiying，Feng Suying，Wang Baoxi.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs;Hospital of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Wang Baoxi，Email:wangbx@ncstdlc.org;Feng Suying，Email:fengsuying2010@aliyun.com

A 55-year-old male patient presented with tense bullae on the extremities and trunk.Histological examination revealed subepidermal vesicles and superficial dermal infiltration of eosinophils and lymphocytes.The patient was primarily diagnosed with bullous pemphigoid.However，serum autoantibodies of the patient bound to the dermal side of salt-split skin，and no serum antibodies against BP180，BP230 or typeⅦ collagen were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Hence，the diagnoses of bullous pemphigoid and epidermolysis bullosa acquisita were excluded.As Western blot and immunoprecipitation analysis showed，there existed antibodies capable of binding to a dermal antigen with a relative molecular mass of 200 000 in the serum of the patient.Based on the above findings，the patient was diagnosed as anti-laminin γ1(p200)pemphigoid.

Anti-laminin γ1 pemphigoid;Anti-p200 pemphigoid;Blotting，Western

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.001

卫生公益性行业科研专项经费(201002016);江苏省重点实验室自拟课题(201220009)

210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院,江苏省皮肤病与性病学重点实验室

王宝玺,Email:wangbx@ncstdlc.org;冯素英,Email: fengsuying2010@aliyun.com