黑斑息肉综合征一家系致病基因的新突变

牟韵竹 张正中 杨浩

黑斑息肉综合征一家系致病基因的新突变

牟韵竹 张正中 杨浩

目的对黑斑息肉综合征一家系的STK-11基因突变进行检测。方法PCR扩增此家系的患者和健康人的STK-11基因的全部外显子,并测序寻找致病突变,选取100例健康人作为对照。结果该家系患者STK-11基因外显子9的第1251位发生G/T杂合突变。家系中健康对照个体和健康对照中均未发现相应突变。结论错义突变A417S可能影响基因转录和翻译产物,是STK-11基因新的特异性突变。

Peutz-Jeghers综合征;基因,STK-11;突变

黑斑息肉综合征又称Peutz-Jeghers综合征(PJS)。该病是以皮肤黏膜色素沉着伴胃肠道多发息肉为特征的常染色体显性遗传病,息肉组织病理特征属于错构瘤。基因连锁分析将PJS致病基因定位于染色体19P13.3,研究表明,其上的SK11基因((丝氨酸/苏氨酸激酶)的异常是PJS的主要致病原因[1-2]。本文报道四川汉族PJS一家系,并通过PCR和DNA直接测序法对该家系进行SK11基因的突变检测。

一、对象和方法

(一)病历资料:PJS家系来自于四川省,共调查3代10人,患病2人。研究对象为先证者及其母亲2人。先证者,男,19岁,口唇起黑点15年,腹痛1个月余就诊。15年前患者口唇部出现针尖至米粒大小的棕色至黑色斑点,无疼痛及瘙痒感,未引起重视,皮损逐渐增多,近年来无明显变化。3年前患者出现腹痛,便血,入住我院普外科。皮肤科检查:皮损位于口唇黏膜,可见散在或密集的棕色斑及黑斑(图1);胃肠镜检查结果示:胃多发性息肉、结肠多发性息肉(图2);组织病理诊断为腺瘤样息肉,符合黑斑息肉综合征。手术切除后好转出院。1年前随访,患者死于结肠癌。先证者父亲有口唇黏膜黑斑病史,39岁死于胃癌。母亲未见发病,父母非近亲结婚。

(二)方法:

图1 先证者口唇黏膜可见散在或密集的棕色斑点及黑斑

图2 胃肠镜结果 2a:胃多发性息肉;2b:多发性结肠息肉

1.基因组DNA提取:在征得患者及其家属知情同意后,经医院伦理委员会批准,采集先证者及其母亲外周静脉血5 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中抗凝,采用盐析法提取基因组DNA,并同时提取100例无亲属关系健康人的基因组DNA(已签署知情同意书)作为对照,以排除可能存在的基因多态性。

2.引物设计采用Primer 5.0引物设计软件设计,根据SK11基因的10对外显子序列设计引物并进行PCR扩增,其中9号外显子序列为F:5′-TTGTCAGCTTGCCTCCTACTC-3′;R:5′-GGAATGCACCCACTCTGAGA-3′;Fi:5′-TGAGGTT CCTGCAGTCAGTAC-3′,Ri:5′-GGTCACCATGACTGACTAGC G-3′扩增出1 416 bp产物。

3.PCR扩增:反应体系为50 μl,10×缓冲液 5 μl, primer(20 mmol/L)1.0 μl×2,dNTP(10 mmol/L)1.0 μl,MgCl2(25 mmol/L)5 μl,Taq酶0.5 μl,模板DNA 1.0 μl,ddH2O 35.5 μl扩增条件:95℃预变性3 min;94℃变性30 s,55～60℃退火30 s,72℃延伸40～60 s,共25个循环;72℃后修复延伸5～8 min。将扩增产物纯化后送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

二、结果

该家系中先证者检测出SK11基因9号外显子第1251位碱基发生G-T错位,即417位密码子由GCC变为TCC,丙氨酸变成了丝氨酸(图3)。其母亲和无亲缘关系的100例健康对照均未发现此突变位点,说明此突变是该家系的一个致病突变而非单核苷酸多态性。

图3 SK11基因测序结果 3a:在患者第9外显子第1251位发生G/T错义突变,使417位密码子由GCC变成TCC;3b:正常对照

三、讨论

PJS发病率约为1/20万,其发病与STK11基因密切相关。STK11基因又名LKB1基因,是一种肿瘤抑制基因,对细胞能量代谢、细胞的增殖与分化有重要的关系[3]。另有研究表明,LKB1基因突变影响P53的活性,其可能在P53诱导的细胞凋亡中也发挥着作用[4-5],其抑癌的具体分子机制尚未完全明确。PJS的肿瘤发病率比一般人高出9～18倍[6]。研究表明,在PJS患者中有50%～90%发现有STK11基因突变[7-8]。目前已经发现的STK11基因突变有145种胚系突变和40种体系突变,突变方式主要包括基因的杂合缺失,移码突变、无义突变、错义突变,插入突变等。STK11基因突变可导致其编码的一种丝氨酸/苏氨酸激酶失活,其表达水平的降低可导致体细胞其他肿瘤相关基因突变的累积,最终致恶性肿瘤的发生。本例患者最终死于结肠癌也说明了此错义突变可能干扰STK11/LKB1的功能，,影响基因转录和翻译产物,使细胞增殖失控,从而发生癌变。

本研究发现,患者STK11基因9号外显子第1251位碱基发生G-T错位,即417位密码子由GCC变为TCC,丙氨酸变成了丝氨酸。而家系中其母亲和无亲缘关系的100例健康对照均未发现此突变位点,证实此突变是该家系的致病突变而不是单核苷酸多态性,表明此错义突变A417S是导致患者发病的一种新的突变[9]。

[1]Amos CI，Bali D，Thiel TJ，et al.Fine mapping of a genetic locus for Peutz-Jeghers syndrome on chromosome 19p[J].Cancer Res，1997，57(17):3653-3656.

[2]Hemminki A，Tomlinson I，Markie D，et al.Localization of a susceptibility locus for Peutz-Jeghers syndrome to 19p using comparative genomic hybridization and targeted linkage analysis [J].Nat Genet，1997，15(1):87-90.

[3]Boudeau J，Sapkota G，Alessi DR.LKB1，a protein kinase regulating cell proliferation and polarity[J].FEBS Lett，2003，546(1):159-165.

[4]Karuman P，Gozani O，Odze RD，et al.The Peutz-Jegher gene product LKB1 is a mediator of p53-dependent cell death[J].Mol Cell，2001，7(6):1307-1319.

[5]Scott R，Crooks R，Meldrum C.Gene symbol:STK11.Disease: Peutz-Jeghers Syndrome[J].Hum Genet，2008，124(3):300.

[6]van Lier MG，Westerman AM，Wagner A，et al.High cancer risk and increased mortality in patients with Peutz-Jeghers syndrome [J].Gut，2011，60(2):141-147.

[7]王昌媛，刘华，宗金宝，等.Peutz-Jeghers综合征STK11基因突变研究[J].中华皮肤科杂志，2014，47(1):39-41.

[8]Hearle N，Schumacher V，Menko FH，et al.Frequency and spectrum of cancers in the Peutz-Jeghers syndrome[J].Clin Cancer Res，2006，12(10):3209-3215.

[9]康晓静，田艳，高峰，等.Peutz-Jeghers综合征STK11基因突变研究[J].中华皮肤科杂志，2010，43(4):263-265.

2013-10-10)

(本文编辑:吴晓初)

A novel mutation in the STK-11 gene in a pedigree with Peutz-Jeghers syndrome

Mu Yunzhu，Zhang Zhengzhong，Yang Hao.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China.

Zhang Zhengzhong，Email:laowaiaeo@163.com

ObjectiveTo detect mutations in the STK-11 gene in a pedigree with Peutz-Jeghers syndrome (PJS).MethodsBlood samples were collected from a 19-year-old male patient with PJS and his unaffected mother，as well as from 100 unrelated healthy human controls.PCR was performed to amplify all the exons of the STK-11 gene followed by sequencing.ResultsA novel heterozygous missense mutation(G-to-T transition)was identified at position 1251 in the exon 9 of the STK-11 gene in the patient，but not in his mother or the unrelated healthy human controls.ConclusionsThe missense mutation A417S，which may affect gene transcription and translation，is a specific novel mutation of STK-11 gene.

Peutz-Jeghers syndrome;Genes，STK-11;Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.021

四川省教育厅自然科学基金(09ZC047)

637000四川南充,川北医学院附属医院皮肤科

张正中,Email:laowaiaeo@163.com