黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞及其耐药细胞株体外抑制作用的研究

刘博，程树杰

（河北大学，河北 保定 071000）

黄药子为薯蓣科 （Dioscoreaceae）黄独（Dioscorea bulbifera L）的块茎[1]。黄药子具有凉血、降火、消瘿、解毒、化痰散结的功效，可用于治疗多种疾病[2-4]，具有一定的毒性[5]，同时，近年来研究以黄药子为主药的中药制剂可用于治疗各种肿瘤[6]。随着黄药子药理作用的研究，其抗肿瘤活性成分也受到了极大的关注[7]，其中黄独乙素（Diosbulbin B）是黄药子中所含的主要生物碱之一，在黄药子抗肿瘤活性得到研究证实的同时，研究发现黄独乙素对胃癌具有治疗作用[8]。本研究实验通过比较黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞及其耐药细胞株的增殖抑制效果，从而阐明黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用是否受到该细胞株对其他化疗药物耐药的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

黄独乙素（四川省维克奇生物科技有限公司），注射用顺铂、5-FU、阿霉素，四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国sigma公司）。黄独乙素溶解在DMSO中，浓度为800μmol/L，4℃保存；顺铂、5-FU、阿霉素溶解于DMSO中，浓度为400μmol/L，4℃保存，实验中用相应的培养液或溶剂稀释。人低分化胃腺癌细胞株SGC-7901（河北大学附属医院中心实验室提供）。实验分为4个大组进行，根据使用细胞株的不同分为SGC-7901细胞株实验组、SGC-7901/顺铂细胞株实验组、SGC-7901/5-FU细胞株实验组、SGC-7901/阿霉素细胞株实验组，根据黄独乙素毒理作用[5]，四组均采用10μmol/L、20μ mol/L、40μ mol/L、80μ mol/L、160μmol/L浓度黄独乙素处理，阴性对照组为不含黄独乙素的等量DMSO，空白组为等量培养基。

1.2 方法

1.2.1 胃癌耐药细胞株的建立

选取处于对数生长期细胞，向培养瓶内加入不同浓度的顺铂、5-FU、阿霉素，于37℃、5%CO2培养箱内孵育48 h后撤药，继续观察细胞的死亡情况3 d，选择含顺铂、5-FU、阿霉素浓度分别为5、10、2μmol/L的完全RPMI-1640培养液(约20%的抑制浓度)作为耐药细胞培养的起始浓度，设定顺铂浓度梯度为5—10—15—20—25—30—35—40—45—50μmol/L，5-FU浓度梯度为10—20—30—40—50—60—70—80—90—100μ mol/L，阿霉素浓度梯度为 2—4—6—8—10—12—14—16—18—20μmol/L。

1.2.2 MTT用于细胞增殖及细胞活性测定

测定黄独乙素对SGC-7901、SGC-7901/顺铂、SGC-7901/5-FU、SGC-7901/阿霉素细胞增殖的影响。

1.2.3 计算抑制率

1.2.4 统计学处理

所有计量资料以x±s表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析，P＜0.05表明差异有统计学意义，P＞0.05表明差异无统计学意义。

2 结果

2.1 收集MTT数据（吸光度），计算抑制率

由所取得数据可发现，4种细胞株分别加入10μmol/L、20μmol/L、40μ mol/L、80μmol/L、160μmol/L黄独乙素所测得的吸光度与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），（表1）；同时，3种耐药细胞株与加入同样浓度黄独乙素的SGC-7901细胞株所测得的抑制率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），（表 2）。

表1 4种细胞株实验组加入不同浓度黄独乙素所测得吸光度（x±s）

表2 4种细胞株实验组加入不同浓度黄独乙素所测得抑制率（x±s）

2.2 数据分析

2.2.1 不同浓度的黄独乙素对SGC-7901、SGC-7901/顺铂、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素细胞株抑制率影响

加入相同浓度黄独乙素后SGC-7901、SGC-7901/顺铂、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素细胞株抑制率接近，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1、表2），表明黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞株的增殖抑制作用并没有受到细胞株对顺铂、5-FU、阿霉素耐药的影响。

图1 黄独乙素对4种细胞株的抑制率

2.2.2 加入不同浓度黄独乙素后SGC-7901细胞株及其耐药细胞株抑制率变化曲线

黄独乙素对SGC-7901细胞株及其耐药细胞株的增殖抑制率随浓度变化曲线非常相似，表明黄独乙素对SGC-7901、SGC-7901/顺铂、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素细胞株具有相似的增殖抑制作用，并且呈现一定程度的浓度依赖性，也就是说黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞株增殖抑制作用的剂量依赖性并未受到细胞株对顺铂、5-FU及阿霉素产生耐药的影响（图2）。

图2 4种细胞株抑制率随黄独乙素浓度变化曲线

3 讨论

随着研究逐渐深入，中药抗肿瘤机制也逐渐被发现并证实，目前人们所证实的中药的抗肿瘤作用有：（1）增强机体免疫力，中药可以调控体内的淋巴细胞产生一些如IL、TNF等细胞因子，进而增强患者体内的免疫调节功能[9]；（2）直接抑制肿瘤细胞生长与增殖，中药可作用于肿瘤细胞生长的不同阶段，严重阻碍细胞生长所需要DNA、RNA 蛋白质的合成，使肿瘤细胞停止于增殖周期某阶段； 或作用于肿瘤细胞能量代谢某环节，导致肿瘤细胞呼吸链受阻而死亡； 或破坏细胞膜引起细胞自溶死亡[9]；（3）抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力，大多数肿瘤细胞具有很强的侵袭转移能力，也是肿瘤患者在短时间内死亡的主要原因，中药可以有效降低肿瘤细胞的侵袭能力，延缓其转移速度[10]；（4）诱导肿瘤细胞的凋亡，肿瘤的发生多源于抑癌基因的失活或者原癌基因的激活，中药可通过促使异常表达的癌基因得到逆转、关闭或降低而达到抑癌作用[11]；（5）改变或阻滞肿瘤细胞的周期，中药可作用于肿瘤细胞不同的细胞周期，使之发生停滞或者分化以达到抑癌作用[12]；（6）抑制肿瘤血管生成，肿瘤细胞不可能脱离血供而快速增殖，中药可抑制肿瘤血管生成，通过减少肿瘤组织的血供来抑制肿瘤生长[13]；（7）逆转多药耐药，增强常规化疗药物的作用，肿瘤细胞对常规化疗药物的多药耐药是化疗中的重要难题，中药可以通过多种方式降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药程度，从而辅助化疗药物抑制肿瘤生长[14]。目前黄独乙素抑制癌瘤细胞增殖的具体机制仍不完全清楚，本实验发现，黄独乙素能够直接抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长和增殖，证实，黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞具有明显抑制细胞增殖的作用，虽然未检测发现其有效浓度区间，但效果仍然值得关注，黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用呈现出一定程度的浓度依赖性。近年来国内发表多篇关于黄药子及黄独乙素抗肿瘤作用的类似报道[15-17]，但不排除黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制存在其他方面的机制，需进一步研究。

当前临床应用的一线化疗药物之间，或多或少存在着一定程度的交叉耐药，当肿瘤对于某一种化疗药物产生耐药后，其他化疗药物对该肿瘤所产生的抑制效果有一定程度的降低，尤其是相同作用机制的化疗药物[18]。以往国内外中药的研究多针对其自身对肿瘤细胞的增殖抑制作用，而中药对肿瘤细胞的耐药细胞株的增殖抑制作用研究较少，近年来，国内外学者将目光转向了中药的辅助化疗作用，比如有效抑制耐药细胞增殖、逆转多药耐药等研究方向[19]。黄独乙素在本实验中表现出对人胃癌SGC-7901细胞的低交叉耐药性，人胃癌SGC-7901细胞对顺铂、5-FU、阿霉素产生耐药并未影响黄独乙素对其增殖抑制效果，这是传统化疗药物难以克服的难题，也是化疗失败或者效果欠佳的主要原因，同样也是当前研究所希望发现的中药辅助化疗的作用。黄独乙素作为中药单一成分所表现出来的这种低交叉耐药性是未来研究中开发新型化疗药物应该重视的，也是未来中药抗肿瘤研究的热点。

[1]江苏中医学院. 中药大辞典(下册)[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1977: 2059-2061.

[2]YANG Ling. Incidence and mortality of gastric cancer in China[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(1): 17-20.

[3]谭兴起, 阮金兰, 陈海生, 等. 黄药子抗炎活性成分的研究[J]. 第二军医大学学报, 2003, 24(6): 677-679.

[4]李国进. 黄药子在治疗亚急性甲状腺炎中的作用[J]. 天津中医药, 2003, 20(2): 9.

[5]翟为民, 张力. 黄药子的安全性评价与风险控制措施探讨[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(17): 2355-2359.

[6]索晴, 崔立然, 刘树民, 等. 黄药子及配伍当归后含药血清抗肿瘤作用的研究[J]. 中国中医药科技, 2008, 15(2): 113-114.

[7]喻泽兰, 刘欣荣, MCCULLOCH M, 等. 黄药子抗肿瘤活性组分筛选及作用分析[J]. 中国中药杂志, 2004, 29(6): 563 -567.

[8]赵继森, 程树杰, 李鹏凯. 黄独乙素抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖作用[J]. 医学研究与教育, 2013, 30(3): 13-15.

[9]程樱, 张立. 中药抗肿瘤机制及药物研究进展[J]. 中国药业, 2013, 22(17): 103-104.

[10]吕贺, 朴成国, 李香丹, 等. 中药抗肿瘤机制的研究现状[J]. 医学综述, 2011, 17(19): 3304-3306.

[11]李庆, 范晓磊. 中药抗肿瘤的研究进展[J]. 中国微生态学杂志, 2007, 19(3): 317-318.

[12]廖美德, 梁世中. 中药抗肿瘤机理的研究进展[J]. 贵阳中医学院学报, 2001, 23(4): 52-54.

[13]季秀海, 钱晓萍. 中药有效成分抗肿瘤血管生成研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2010, 18(3): 594-597.

[14]李学涛, 谭静净, 喻荣平, 等. 中药逆转抗肿瘤药物多药耐药性研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报, 2013, 15(1): 155-158.

[15]李春峰, 邱军强, 苗晶囡, 等. 黄药子体外抗胃癌活性成分的筛选及分析[J]. 中成药, 2014, 36(2): 387-390.

[16]李俊萱, 于海食, 宋雨婷, 等. 黄药子的现代研究进展[J]. 中国医药指南, 2013, 11(26): 52-55.

[17]赵许杰, 闫雪生, 孙丹丹. 黄药子的药理作用和临床研究进展[J]. 药物评价研究, 2012, 35(2): 147-149.

[18]陈云龙, 吴勉华. 中医药逆转肿瘤多药耐药性研究现状及局限性分析[J]. 山东中医杂志, 2014, 33(3): 238-239.

[19]王洁茹, 张婷婷, 程晓东. 中药抗卵巢癌侵袭转移及化疗耐药的研究[J]. 实用肺瘤杂志, 2014, 29(1): 98-102.