hnRNP H与子宫内膜癌化疗敏感性的相关性

赵向寨 王 璟 卢庆玲 李 萍 郭 影 (河北医科大学第三医院，河北 石家庄 05005)

子宫内膜癌是围绝经及绝经后妇女常见生殖道肿瘤之一，近年全球发病率逐年上升。在我国，子宫内膜癌的发病率也呈上升趋势。核不均一核糖核蛋白家族(hnRNPs)，参与多种疾病发生发展过程，尤其与肿瘤关系密切，沉默hnRNP A2B1基因抑制癌症细胞生长已经在多种类型癌症中得到证实〔1〕，但与hnRNP A/B亚族功能相似的hnRNP F/H亚族的研究相对较少。本文拟研究hnRNP H在子宫内膜癌组织及细胞中的表达及沉默hnRNP H基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞紫杉醇化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 标本 标本来源于2010年1月至2012年1月就诊我院妇科、初诊病理提示子宫内膜癌患者59例，未给予先期放、化疗，手术切除留取子宫内膜腺癌蜡块标本。年龄(47.28±5.71)岁，病理证实均为子宫内膜腺癌，癌旁组织均证实无癌细胞浸润。所有病理切片均由2位高年资病理科医师复查。人子宫内膜癌细胞株Ishikawa购于中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO公司;hnRNP H抗体、hnRNP H siRNA、Control siRNA-A、siRNA转染试剂购自 Santa Cruz公司;紫杉醇注射液购自海口市制药厂有限公司、免疫组化试剂盒及凋亡Caspase 3/9、Bax、Bcl-2抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SP法检测组织中hnRNP H表达 采用免疫组织化学SP法，工作浓度为1∶100。石蜡组织5 μm连续切片，切片脱蜡水化，抗原修复，3%H2O2甲醇灭活内源性过氧化物酶活性，依次滴加一抗、二抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片，检测hnRNP H表达情况，用已有阳性切片作为阳性对照，用PBS取代一抗作为阴性对照。结果判定:染色阳性的细胞质和(或)核呈棕黄色颗粒。采用image-plus图像分析系统，每一切片400倍下随机选取5个视野计算每一切片的平均光密度，进而得出该组阳性细胞的平均光密度值。未出现黄色或棕色颗粒为阴性表达。

1.2.2 细胞培养 Ishikawa细胞株经10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素 DMEM 培养基培养，37℃、5%CO2饱和度和湿度恒温培养箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞。胰酶消化细胞计数，稀释细胞，使得细胞密度为4×105个/ml，铺于无菌6孔培养板中，培养12 h至Ishikawa细胞融合率达50%，弃去原细胞培养液，换无血清DMEM培养液，按转染试剂盒说明书要求用Transfection regent稀释 hnRNP H siRNA、Control siRNA及转染试剂Transfection medium/regent。实验分组:正常培养Ishikawa细胞组(con)、转染hnRNP H siRNA细胞组、转染Control siRNA细胞株。转染试剂作用6 h，无血清培养基冲洗细胞，换含血清、抗生素培养基继续培养。于转染24 h后，分别搜集细胞提取总RNA及总蛋白待测。

1.2.3 实时定量(Real-time)PCR检测hnRNP H RNA表达转染后24 h，提取总 RNA，测定 A260/A280 值介于 1.8 ～2.0。以β-actin作为内参，总RNA浓度为1 mg/ml进行逆转录，将cDNA为模版进行PCR反应，PCR反应条件:预变性95℃ 10 s，95℃ 5s，60℃ 30 s，目的基因30个循环，内参循环数设定为25个循环。扩增完毕，分析溶解曲线，以β-actin为内参，利用CT值计算各组hnRNP H mRNA相对值。hnRNP H引物序列:5'-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3'，5'-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3';内参引物序列5'-GGTCCTACGTTCACCAACACA-3'，5'-CTCTGGGTCACATGGCTCT-3'。

1.2.4 Western印迹法检测hnRNP H蛋白表达 转染24 h，提取各组细胞，预冷PBS洗涤，于冰上进行操作，细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，BCA法蛋白定量，各组取等量细胞总蛋白于12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，半干法转至NC膜，含5%脱脂奶粉 TBS室温封闭1 h，一抗 hnRNP H(鼠抗1∶200，SANTA CRUZ)和 GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃过夜;二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶5 000)37℃ 1 h;ECL显影，凝胶成像系统扫描。

1.2.5 四甲基偶氮唑盐(MTT)检测紫杉醇对Ishikawa细胞存活率的影响 将呈对数期生长的Ishikawa细胞计数，以5×103/ml、100 μl/孔接种于 96 孔板，于 37℃、5%CO2恒温无菌培养箱中继续培养，12 h细胞融合达70%，分别加入不同浓度紫杉醇(5、10、20、50 mg/L)，各设 3 个复孔，继续培养 24 h，每孔加入浓度为5 mg/ml MTT 10 μl，继续培养4 h，弃去培养液后每孔加入二甲基亚砜150 μl，微量振荡器振荡30 min，酶标仪测定各孔的吸光度A值(A570)及细胞存活率。

1.2.6 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 将呈对数生长期的Ishikawa细胞1×104/ml接种于6孔板中培养，细胞生长状态良好，不同组(对照组、紫杉醇组、siRNA组、紫杉醇+siRNA组)加入紫杉醇继续培养24 h，收集并制成细胞悬液，70%冷乙醇固定，4℃储存过夜。预冷 PBS洗涤，加入 PI、RNase，避光染色30 min，PI染色流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.7 Western印迹检测各组细胞凋亡蛋白(Caspase 3/9 Bcl-2、Bax)的表达 将呈对数生长期的Ishikawa细胞1×104/ml接种于6孔板中培养，细胞生长状态良好，经转染及化疗药物作用后(处理方法同上)，于冰上在细胞中加入细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，蛋白定量，各组取等量细胞总蛋白于12%SDSPAGE电泳分离蛋白，半干法转至NC膜，含5%脱脂奶粉TBS室温封闭1 h，分别加一抗Caspase 3/9(Caspase 3/9鼠抗1∶500)、Bcl-2(鼠抗1∶250)、Bax(鼠抗 1 ∶1 000)和 GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃ 过夜;二抗(羊抗鼠或羊抗兔 1 ∶5 000)37℃ 1 h;ECL显影，凝胶成像系统扫描。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件行χ2检验。两组均数比较用成组t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 hnRNP H基因在子宫内膜癌组织中的表达 免疫组化结果显示:子宫内膜癌组织中hnRNP H呈现高表达，显著高于癌旁正常组织，经Image-plus图像分析系统分析两组IOD值学存在显著差异(P＜0.05)。见图1。

图1 hn RNP H基因在子宫内膜癌及癌旁组织中的表达(×400)

图2 Western印迹检测hnRNP H蛋白表达

2.2 hnRNP H mRNA及蛋白表达 Real-time PCR及Western印迹检测，hnRNP H mRNA及蛋白在siRNA干扰组表达均明显下调，与Con及阴性对照(Mock)相比有显著差异(P＜0.05)，从而证明siRNA敲低基因表达有效，敲低效率近70%左右。见图2。

2.3 MTT检测紫杉醇对Ishikawa细胞存活率的影响 紫杉醇在20 μg/ml，细胞生存近53%，接近半数抑制率，有此确定药物作用浓度20 μg/ml，整体看来，紫杉醇可以降低Ishikawa细胞活性(P＜0.05)。

2.4 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率的变化 紫杉醇联合siRNA组细胞凋亡率(45.03%)较高于对照组(3.07%)、紫杉醇组(29.16%)、siRNA 组(34.72)P＜0.05)，见图 3。

2.5 各细胞 Caspase-3/9、Bcl-2、Bax的表达变化 Caspase-9/3、Bax表达在紫杉醇+siRNA组均显著上调，与对照组、紫杉醇组及siRNA组相比有统计学差异(P＜0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2在紫杉醇+siRNA组表达明显下调，与对照组、紫杉醇组及siRNA组相比有统计学差异(P＜0.05)，见图4。

图3 流式细胞代检测各组细胞凋亡率

图4 Western印迹检测各组细胞Caspase-3/9、Bcl-2、Bax 的表达

3 讨论

化疗是治疗子宫内膜癌的主要手段。提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性，减少耐药的发生，将提高子宫内膜癌患者生存率、改善生活质量。hnRNP家族是由蛋白质小分子组成的复合体，为核内RNA结合蛋白，参与RNA转录、外显子剪接、选择剪接位点、参与 pre-mRNA 的成熟、降解〔1〕，与肿瘤的发生、发展密切相关。hnRNP A2/B1结合至端粒单链，激活端粒酶，可作为癌症的早期诊断指标〔2，3〕。基因水平靶标治疗是针对癌症的新方法，提高肿瘤对化疗药的敏感性，增强化疗药物疗效〔4〕。研究发现，多药联合化疗有效率较单药明显提高，但多药联合毒副反应明显增加〔5～7〕。因此，如何提高一线化疗药敏感性是众多学者的研究重点。

本研究提示沉默hnRNP H后子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡率明显增加，说明对紫杉醇敏感性明显增加。Western印迹测定各组细胞 Caspase-3/9、Bcl-2、Bax的表达，提示 hnRNP H与子宫内膜癌细胞紫杉醇耐药有密切关系，同时提示子宫内膜癌患者对紫杉醇耐药可能是由于hnRNP H在子宫内膜癌组织中高表达。

本研究结果为子宫内膜癌耐药机制提供了新的基础依据，明确hnRNP H在子宫内膜癌组织及细胞中高表达，通过沉默hnRNP H基因能有效提高子宫内膜癌细胞对紫杉醇的敏感性，肿瘤细胞凋亡率增加，凋亡蛋白表达异常，为子宫内膜癌的治疗提供了新的分子生物学指标。

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