补中益气丸补气疗效的谱-效关系研究Δ

胡芳，杨英来，刘小花，朱瑞娟，李灿，封士兰（兰州大学药学院，兰州730000）

补中益气丸是临床常用中成药，由君药黄芪，臣药党参、甘草（蜜炙）、白术（炒），佐药当归、升麻，使药柴胡、陈皮组成，具有补中益气、升阳举陷之功能[1]，在临床上尚有健脾化湿、升清降浊等作用[2]。该方组方严谨，用药精良，其中“益气升阳”配伍是该方的一大特色[3]。

中药复方制剂化学成分复杂[4]，其药理作用是各味药材中多种有效成分的综合作用[5]。目前有关补中益气丸的研究多数集中于含量测定[6-7]以及指纹图谱[8-9]的研究上，但指纹图谱与补气作用的谱-效相关性研究未见文献报道。笔者同时建立了补中益气丸的高效液相色谱（HPLC）-二极管阵列检测器（DAD）和HPLC-蒸发光散射检测器（ELSD）指纹图谱，将两者分别与其补气作用进行了谱-效关联度分析，全面评价了补中益气丸的质量。

1 材料

1.1 仪器

2695型HPLC仪，包括2996型DAD、Millenium32型色谱管理站、Oasis HLB 3cc型固相萃取（SPE）小柱（美国Waters公司）；ALTCH 2000型蒸发光散射检测器（ELSD，美国奥泰公司）；KQ-400DE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；UV1700型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；BP211D型十万分之一天平、BS224S型万分之一天平（德国赛多利斯公司）；MIKRO 22型离心机（德国Hettich公司）；1.0版中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件（中南大学）。

1.2 药品与试剂

补中益气丸[兰州太宝制药有限公司，批号：83111110（A）、83111213（B）、83121124（C）、83121003（D）、83120875（E）；兰州佛慈制药股份有限公司，批号：12J52（F）、12F39（G）、12J50（H）、12F40（I）、12J49（J）]；毛蕊异黄酮（批号：111530）、黄芪甲苷（批号：110781）、橙皮苷（批号：721）、洋川芎内酯Ⅰ（批号：12062722）对照品均购自上海一林生物科技有限公司（纯度均＞98%）；藁本内酯（批号：110612-20013700）、芒柄花素（批号：110714-200501）对照品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.3 动物

KM种小鼠120只，♀♂兼用，体质量18～22 g，由兰州大学动物实验中心提供[实验动物使用合格证号：SCXK（甘）2009-0004]。

2 方法

2.1 补中益气丸补气作用研究

对小鼠控制饮食（喂食量为平时的1/2），并进行力竭游泳，游泳水温控制在25℃，不能以尾撑桶边休息，每天1次，连续14 d[10]，以复制小鼠力竭模型。力竭标准为游泳最后下沉，经10 s后仍不能返回水面[11]。120只小鼠随机均分为12组，即正常对照（等容生理盐水）组、模型（等容生理盐水）组与补中益气丸①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，1.06 g/kg）组。复制模型成功后ig给药，每天1次，连续10 d。末次给药后0.5 h，尾iv20%印度墨汁0.01 ml/g，于iv后2 min（t1）、10 min（t2），分别从眼静脉丛取血 20 μl，溶于 2 ml 0.1%NaHCO3溶液中，摇匀，用分光光度计在600 nm波长处测定吸光度（A）。将小鼠脱臼处死，分别称肝、脾和胸腺质量，按下式计算胸腺或脾脏指数：

胸腺或脾脏指数＝胸腺或脾脏湿质量（mg）/体质量（g）

再按下式计算廓清指数（K）或校正廓清指数（α，表示吞噬活性）：

K＝（lgA1－lg A2）（/t2－t1），α＝体质量（/肝质量+脾质量）[12]

2.2 补中益气丸指纹图谱研究

2.2.1 溶液的制备 （1）供试品溶液的制备：称取补中益气丸粉末2.5 g，置100 ml锥形瓶中，加60 ml甲醇浸泡，超声30 min，滤过，残渣加40 ml甲醇，超声30 min，滤过。合并滤液，蒸干，加3 ml水溶解，以离心半径为8.69 cm、10000 r/min离心6 min，取上清液用SPE小柱纯化[13-14]（SPE小柱预先用7.5 ml甲醇和7.5 ml水活化），分别用1.0 ml水、1.0 ml 10%甲醇、1.0 ml 90%甲醇洗脱，收集10%甲醇和90%甲醇的洗脱液，混合，氮吹，加甲醇定容至2 ml，0.45µm微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液。（2）对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯、黄芪甲苷对照品各适量，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得橙皮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯、黄芪甲苷质量浓度分别为0.135、0.210、0.144、0.180、0.164、0.186 mg/ml的对照品溶液。

2.2.2 色谱条件色谱柱：思博尔ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（程序见表1）；流速：1.0 ml/min；检测波长：290 nm；柱温：30℃；漂移管温度：110.5 ℃；载气流速：3.1 ml/min；进样量：30 μl。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab 1 Gradient program procedure of mobile phase

2.2.3 供试品测定 按“2.2.1”项下方法平行制备10批样品的供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液30 μl，注入HPLC仪，按“2.2.2”项下色谱条件测定，记录80 min色谱图。

2.3 补中益气丸指纹图谱与药效作用灰关联度分析

灰关联度分析来自灰色系统理论，具有整体性的特点。如果两个因素同步变化程度较高，则两者关联度大；反之，两者关联度小。选取α作为药效参数，对补中益气丸HPLC-DAD和HPLC-ELSD指纹图谱与补气疗效进行灰关联度分析。

3 结果

3.1 补中益气丸的补气作用

与正常对照组比较，模型组小鼠体质量增加，胸腺指数、脾指数、K、α减小，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，补中益气丸①、③、④、⑥、⑧、⑨、⑩组小鼠体质量增加，胸腺指数、脾指数、K、α增加，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；补中益气丸⑤、⑦组小鼠体质量增加，脾指数、K、α增加，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；补中益气丸②组小鼠体质量增加，胸腺指数、K、α增加，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。补中益气丸对模型小鼠体质量、脏器指数的影响见表2；对K、α的影响见表3。

表2 补中益气丸对模型小鼠体质量、脏器指数的影响（±s，n＝10）Tab 2 Influence of Buzhong yiqi pills on body weight and viscera index of model mic（e±s，n＝10）

表2 补中益气丸对模型小鼠体质量、脏器指数的影响（±s，n＝10）Tab 2 Influence of Buzhong yiqi pills on body weight and viscera index of model mic（e±s，n＝10）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组补中益气丸①组补中益气丸②组补中益气丸③组补中益气丸④组补中益气丸⑤组补中益气丸⑥组补中益气丸⑦组补中益气丸⑧组补中益气丸⑨组补中益气丸⑩组脾指数3.58±0.312.60±0.41＊3.36±0.43##3.14±0.513.41±0.37##3.46±0.30##3.30±0.56#3.53±0.65##3.45±0.36##3.50±0.43##3.51±0.54##3.44±0.85#体质量增加值/g 0.96±0.218.68±1.53＊11.00±1.90#10.71±1.45#12.11±0.96##11.34±2.13#12.59±1.86##11.59±1.92##11.64±1.71##12.64±1.88##12.15±1.97##12.48±1.48##胸腺指数3.18±1.871.28±0.28＊2.85±0.52##2.32±0.52##2.27±0.97#2.56±0.80##2.13±0.912.65±0.91##2.16±1.032.42±0.63##2.31±0.58##2.18±0.71##

表3 补中益气丸对模型小鼠K、α的影响（±s，n＝10）Tab 3 Influence of Buzhong yiqi pills on clearance index and correct clearance index of model mic（e±s，n＝10）

表3 补中益气丸对模型小鼠K、α的影响（±s，n＝10）Tab 3 Influence of Buzhong yiqi pills on clearance index and correct clearance index of model mic（e±s，n＝10）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组补中益气丸①组补中益气丸②组补中益气丸③组补中益气丸④组补中益气丸⑤组补中益气丸⑥组补中益气丸⑦组补中益气丸⑧组补中益气丸⑨组补中益气丸⑩组K α 6.3195±0.78044.0610±0.3826＊6.1147±1.3120##5.3451±1.0688#5.2476±0.7544##5.4170±1.1679##5.9625±1.0063##5.2836±1.0011#5.4412±1.1041#6.0132±1.1108##5.0455±0.7059##5.0843±0.7176##0.0427±0.01770.0160±0.0039＊0.0428±0.0224##0.0282±0.0109#0.0286±0.0113#0.0319±0.0192#0.0386±0.0187#0.0358±0.0145##0.0390±0.0212##0.0401±0.0216##0.0241±0.0084#0.0227±0.0064#

3.2 补中益气丸指纹图谱的建立

HPLC-DAD指纹图谱中有21个峰是各供试品所共有的，因此确定这21个峰为共有峰。与对照品的保留时间和紫外数据进行对比，确定11、12、18、19、21号峰分别为橙皮苷、洋川芎内酯Ⅰ、毛蕊异黄酮、芒柄花素、藁本内酯。HPLC-ELSD指纹图谱中有10个峰是各供试品所共有的，其中4、8号峰与对照品橙皮苷、黄芪甲苷的保留时间一致，确定其分别为橙皮苷、黄芪甲苷。10批补中益气丸的HPLC-DAD、HPLC-ELSD指纹图谱分别见图1、图2（图中R为共有模式）。

图1 10批补中益气丸的HPLC-DAD指纹图谱Fig 1 HPLC-DAD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

图2 10批补中益气丸的HPLC-ELSD指纹图谱Fig 2 HPLC-ELSD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

3.3 灰关联度分析

对补中益气丸HPLC-DAD指纹图谱与补气疗效进行灰关联度分析，依据关联度的大小（见表4），确定了各成分（以特征峰编号作为该特征峰所代表的化学成分名称）对补气作用贡献的大小顺序为：7＞8＞6＞11＞4＞9＞19＞14＞1＞16＞3＞13＞15＞18＞12＞5＞17＞2＞21＞10＞20。对补中益气丸HPLC-ELSD指纹图谱与补气疗效进行灰关联度分析，依据关联度的大小（见表5），确定了各成分（以特征峰编号作为该特征峰所代表的化学成分名称）对补气作用贡献的大小顺序为：1＞6＞4＞2＞9＞5＞10＞3＞8＞7。研究结果表明，HPLCDAD与HPLC-ELSD指纹图谱中各峰所代表的化学成分与补气作用均有一定的关联（关联度＞0.62），表明补中益气丸的补气作用均是其所有化学成分共同作用的结果。本研究确认的已知成分中橙皮苷和芒柄花素与补气作用具有较高关联（关联度＞0.78）。

4 讨论

由于单一复制模型方法不能达到满意的效果，笔者采用限制食量和游泳使其疲劳的联合方法复制小鼠气虚模型。复制模型结束后小鼠精神萎靡、毛发稀疏蓬松、尾爪颜色苍白、弓背趴地、活动明显减少且反应迟钝，证明复制模型成功。给药后各给药组小鼠精神状态得到不同程度改善，活动量增大，皮毛光泽，而模型组无明显变化，证明10批补中益气丸对气虚症状均有改善作用。

补中益气丸成分复杂，制剂过程中加入了润湿剂、黏合剂等辅料，干扰杂质较多，色谱图峰形不好。有些化合物不可逆地吸附于色谱柱，导致色谱柱柱效降低、实验重复性差。SPE小柱应用于补中益气丸HPLC供试品溶液的前处理，减少了杂质，获得了理想的色谱，提高了实验可重复性，保证了各样品分析坏境的一致。

表4 10批补中益气丸HPLC-DAD指纹图谱的共有峰与补气疗效之间的关联系数和关联度Tab 4 The correlation coefficient and correlation degree between tonifying qi efficacy and the common peak of HPLCDAD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

表5 10批补中益气丸HPLC-ELSD指纹图谱的共有峰与补气疗效之间的关联系数和关联度Tab 5 The correlation coefficient and correlation degree between tonifying qi efficacy and the common peak area of HPLC-ELSD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

笔者选取K和α作为药效学指标，K反映了机体单核-巨噬细胞系统吞噬细胞的能力，α考虑了个体体质量和脏器质量对吞噬能力的影响，消除了一定的个体误差。结果显示，补中益气丸各组较模型组均能不同程度地提高K和α。指纹图谱与药效数据的相关性分析显示，HPLC-DAD指纹图谱和HPLC-ELSD指纹图谱均与补中益气丸的补气作用有一定对应关系。根据关联度大小，可得出结论：补中益气丸中对补气作用贡献较大的成分有橙皮苷、芒柄花素，更多成分有待进一步研究。

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