p53凋亡刺激蛋白抑制蛋白对乳腺癌患者生存时间的影响

姚朝峰，王长松，王 锋

ASPP1、ASPP2和 ASPP家族抑制成员 （inhibitory member of the ASPP family，iASPP）均属于p53凋亡刺激蛋白 （apoptosis－stimulating protein of p53，ASPP）家族成员［1］，ASPP1／ASPP2 主要与 p53结合共同调节p53蛋白的生物学活性，促使细胞在发生DNA损伤后进入凋亡程序；iASPP的功能则截然相反，它主要竞争性地与p53蛋白结合，抑制野生型p53蛋白的促细胞凋亡活性，具有癌基因的特点。鉴于iASPP的生物学活性，深入研究iASPP在肿瘤细胞内的表达模式及对肿瘤细胞的影响，则有可能改变肿瘤细胞的命运，为高表达iASPP肿瘤的治疗和预后提供一种新的思路。本文分析了iASPP在乳腺浸润性导管癌中的表达，同时对iASPP阳／阴性乳腺癌患者的生存时间进行了分析。

1 资料与方法

1．1 一般资料 收集解放军第150医院1999年01月—2010年12月收治的乳腺浸润性导管癌患者的临床资料，选取其中具有完整临床和随访资料的89例作为研究对象。采用电话随访形式，随访至患者病死或截止日期（2010年12月）。术后2年内随访 1次／3个月，3～5年随访 1次／6个月，5年后随访1次／12个月。随访内容包括患者术后治疗经过，复查时间及结果，肿瘤复发或转移的时间、部位，最终生存状况。患者均为女性浸润性导管癌，年龄27～79岁，中位年龄53．2岁。所有患者均接受了乳腺癌改良根治术。除7例难以耐受化疗不良反应外，其余均按照临床标准化化疗方案完成了6～9个疗程的化疗。中位随访时间为29个月（3～96个月）。

1．2 免疫组化检测 标本经4%中性甲醛液固定，常规HE切片染色。免疫组化采用EnVision二步法，浓缩型抗iASPP抗体购自Abcam公司，经1∶100稀释后应用。加入稀释的iASPP多抗10 μl，置37℃孵箱中孵化30 min，以生理盐水代替一抗作阴性对照；用 0．01M PBS 漂洗 3 次，加入二抗工作液 10 μl，室温下孵化 30 min；用 0．01M PBS漂洗 3次，加入DAB显色液显色，显微镜下观察，待出现特异性的棕色颗粒后终止显色，同时设立阳性、阴性对照。

1．3 统计学分析 采用 SPSS16．0统计软件中的Kaplan－Meier进行生存分析，以 P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 乳腺浸润性导管癌组织中iASPP的表达 89例乳腺浸润性导管癌中有76例表达iASPP（85．4%），13 例不表达（14．6%），见图1。

图1 乳腺浸润性导管癌患者iASPP的表达

2．2 生存分析 至随访结束，iASPP阳性乳腺浸润性导管癌患者病死17例（33．3%），iASPP阴性乳腺癌患者死亡 4 例（10．5%）。通过 Kaplan－Meier法计算生存率得 χ2＝4．627，P＝0．031，两组的生存率差异有统计学意义（图2）。

图2 iASPP阳／阴性乳腺浸润性导管癌患者生存时间比较

3 讨 论

野生型p53诱导细胞凋亡是机体对抗肿瘤的一种重要防御机制。细胞DNA损伤后，野生型p53基因的表达会大幅度增加，产生较多的p53蛋白，促进受损细胞发生凋亡或停滞于S期进行修复。野生型p53蛋白是如何决定DNA受损细胞进入修复程序或凋亡程序的？ASPP家族成员的发现则很好地回答了此问题［1］。ASPP家族成员包括ASPP1、ASPP2和iASPP，三者在结构上极为相似，即都具有3个典型的特征性结构：4个锚蛋白重复序列，SH3结构域和富含脯氨酸的结构域［2］，其中SH3是其与p53结合的必需结构；缺少SH3结构域和／或锚蛋白重复序列的截断型iASPP都不能与p53蛋白结合，因此也不具有抑制细胞凋亡的生物学功能。尽管三者均可与p53蛋白结合，但作用却截然不同。在 ASPP1／ASPP2 存 在 时 ，ASPP1／ASPP2 首 先 与p53结合，诱导p53蛋白与凋亡基因启动子的亲和性发生改变，使DNA受损细胞走向凋亡。ASP1／ASPP2结构的微小变化即可引起p53蛋白的功能发生显著变化，进而影响p53蛋白诱导细胞凋亡的能力。iASPP则主要抑制p53蛋白的促细胞凋亡活性，抑制瘤细胞发生凋亡。

ASPP蛋白家族的发现对肿瘤的发病机制、治疗和预后有着重要影响，通过抑制iASPP的表达可大幅度提高肿瘤对化疗药物的敏感性，促使肿瘤细胞发生凋亡；同时阻断iASPP后也将促使p53蛋白与ASPP1／ASPP2结合，促进DNA受损细胞凋亡。研究显示在淋巴细胞、成纤维细胞和乳腺癌细胞株MCF－7中采用siRNA技术抑制iASPP的表达可以显著增加瘤细胞的凋亡率［3－5］。iASPP 对前列腺癌细胞的增殖和生存是必需的，可能会成为前列腺癌治疗的靶标［6］，iASPP 在肝细胞肝癌［7］和胶质瘤细胞［8］的增殖中也起关键性的作用，iASPP可能是这些肿瘤治疗的潜在靶标。通过下调内源性iASPP的表达能增加白血病细胞依赖 p53的凋亡发生率［9，10］。

150医院课题组在前期的研究中发现，iASPP－mRNA在乳腺浸润性导管癌患者中的表达率为87．9%（51／58）；免疫组化染色结果显示 iASPP 在乳腺浸润性导管癌中的表达率为 91．4%（53／58）。同时也发现在乳腺浸润性小叶癌组织中也有iASPP的表达。不同的年龄组iASPP－mRNA的表达差异也有显著性；iASPP的表达与乳腺浸润性导管癌的TNM分期、淋巴结转移显著相关；但与雌、孕激素受体的表达无关［11－13］。在本研究中笔者针对 iASPP 在乳腺浸润性导管癌患者中的表达差异，研究了阳性患者和阴性患者的生存时间，结果显示经过29～96个月的随访，iASPP表达阳性患者的中位生存时间为（65．4±5．54） 个月，阴性患者的中位生存时间为（82．1±7．76）个月，二者相比差异具有统计学意义。因此提示有必要检测乳腺浸润性导管癌患者中iASPP的表达情况，并加强随访，以期早发现其复发或转移，针对iASPP高表达患者采取必要的靶向治疗，以提高患者的生存时间和生存率。

［1］ Samuels－Lev Y，O Connor DJ，Bergamaschi D，et al．ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53 ［J］．Mol Cell，2001，8（4）：781－794．

［2］陈燕平，刘泽军．ASPP蛋白家族在肿瘤细胞凋亡中的作用［J］．癌变 畸变 突变，2006，18（6）：488－450．

［3］ Laska MJ，Strandbygard D，Kjeldgaard A，et al．Expression of the RAI gene is conducive to apoptosis：studies of induction and interference［J］．Exp Cell Res，2007，313（12）：2611－2621．

［4］ Liu ZJ，Cai Y，Hou L，et al．Effect of RNA interference of iASPP on the apoptosis in MCF－7 breast cancer cells［J］．Cancer Invest，2008，26（9）：878－882．

［5］王长松，李 红，高春芳，等．iASPP对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞株MCF－7凋亡的影响［J］．中国病理生理学杂志，2010，26（2）：282－286．

［6］ Zhang B，Xiao HJ，Chen J，et al．Inhibitory member of the apoptosis－stimulating protein of p53（ASPP） family promotes growth and tumorigenesis in human p53－deficient prostate cancer cells［J］．Prostate Cancer Prostatic Dis，2011，14（3）：219－24．

［7］ Lin BL，Xie DY，Xie SB，et al．Down－regulation of iASPP in human hepatocellular carcinoma cells inhibits cell proliferation and tumor growth［J］．Neoplasma，2011，58（3）：205－210．

［8］ Li G，Wang R，Gao J，et al．RNA interference－mediated silencing of iASPP induces cell proliferation inhibition and G0／G1 cell cycle arrest in U251 human glioblastoma cells［J］．Mol Cell Biochem，2011，350（1－2）：193－200．

［9］ Liu H，Wang M，Diao S，et al．siRNA－mediated down－regulation of iASPP promotes apoptosis induced by etoposide and daunorubicin in leukemia cells expressing wild－type p53［J］．Leuk Res，2009，33（9）：1243－1248．

［10］ Gillotin S．iASPP，a potential drug target in cancer therapy［J］．Leuk Res，2009，33（9）：1175－1177．

［11］王长松，王仰坤，乔 亮，等．癌基因iASPP在乳腺癌细胞株和浸润性导管癌中表达及意义［J］．实用医药杂志，2008，25（10）：1231－1234．

［12］陈燕平，刘泽军，辛海明，等．ASPP家族成员mRNA在乳腺癌细胞株中的表达及意义［J］．解放军医学杂志，2008，33（11）：1393－1394．

［13］陈燕平，孙良起，黄本成，等．癌基因iASPP在乳腺浸润性小叶癌中的表达及其意义［J］．中国普通外科杂志，2010，19（11）：1223－1226．