持续低温灌注转运系统(AirdriveTM)影响犬肾保存的实验研究

朱绪辉 薛文瑞 张 强 王 伟 张际青 张小东 胡小鹏

(首都医科大学附属北京朝阳医院泌尿外科，首都医科大学泌尿外科研究所，北京100020)

器官保存的最主要目的是使移植器官在延长的缺血时间的情况下具有良好的生存力和质量。大多数移植器官采用静止的冷藏保存，而随着心脏死亡捐献的器官和边缘性器官应用的增加，机器灌注的保存方法也引起了临床医生的关注。目前认为，心脏死亡后捐献的器官以及扩大标准的捐献器官对缺血损伤更敏感而机器灌注可能使之更加受益［1-2］。本研究采用荷兰INDES公司生产的AirdriveTM持续机器灌注仪，探讨其对犬肾低温缺血损伤的保护作用。现报告如下:

1 对象与方法

1.1 实验动物

健康草犬1只，由首都医科大学实验动物部提供，实验动物许可证号:27801，犬龄3岁，体质量13 kg，雄性。术前24 h禁食，自由饮水。

1.2 器材和药品

AirdriveTM持续机器灌注仪由荷兰INDES公司提供。灌注液使用UW液。

1.3 手术方法和供肾保存方法

经草犬小腿前静脉建立静脉通路，静脉诱导麻醉后，气管插管吸入全身麻醉。建立中心静脉输液通路。取腹部正中切口，逐层切开，采用腹主动脉插管原位灌注法，灌注液温度维持在0～4℃，灌注压9.8 kPa。待灌至肾脏呈均匀灰白色后切取双侧肾脏。将获取的2只肾脏分别用普通低温保存和持续机器灌注低温保存。普通低温保存的肾脏浸泡在冰水混合的HCA器官保存液中，并置于4℃的低温房间内存放。持续机器灌注保存的肾脏则置于AirdriveTM持续机器灌注仪中，该仪器置于室温下存放。

1.4 观察项目

1.4.1 组织病理学检查

2组肾脏均于保存0、12、24以及48 h后取检，每个时间点分别取不同部位的组织6块，分成不同的2组进行配对比较，即普通低温保存组和持续机器灌注组，部分肾组织用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，修剪后石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，采用光学显微镜观察其病理学改变。

1.4.2 电镜检查

观察肾组织在不同保存方法的情况下，保存不同时间后(0、12、24、48 h)的细胞形态学变化，每个时间点分别取不同部位的组织6块，分成不同的两组进行配对比较，即普通低温保存组和持续机器灌注组)。将标本切成70～80 nm大小，按常规方法制成电镜观察标本，用日立H-7000透射电镜观察。

1.4.3 肾皮质线粒体活性测定

在不同时间段取肾脏皮质标本，每个时间点(0、12、24、48 h)分别取不同部位的组织6块，分成不同的2组进行配对比较，即普通低温保存组和持续机器灌注组)，称质量，制备匀浆。差速离心法分离线粒体，制成线粒体悬液，双缩脲法测定其蛋白质量浓度。Clark氧电极法测定线粒体活性。反应室加线粒体悬液后，依次加入呼吸链反应底物0.5 mol/L、琥珀酸20 μL及50 mmol/L二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)10 μL，分别出现Ⅱ态及Ⅲ态呼吸，待 ADP完全磷酸化后，出现Ⅳ态呼吸，连续描记四态呼吸曲线。根据反应室体积和氧饱和度计算记录纸每小格代表的氧含量 ，Ⅲ态或Ⅳ态耗氧速率(R3或R4)=每小格氧含量×Ⅲ态或Ⅳ态每分钟耗氧格数(nmol/min)。计算线粒体呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR=R3/R4)和磷氧比 (phosphorus oxygen ratio，P/O=ADP量/Ⅲ态耗氧量 )。

1.5 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差(±s)表示，同一时间点2组间差异用配对t检验方法分析比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组保存不同时间供肾肾组织病理学改变

0～24 h肾组织的结构基本相似。但48 h后，普通低温保存的肾脏出现较明显的改变，其中肾小管上皮细胞的改变比肾小球更为明显。

实验前，肾小球未见显著变化，肾小管上皮部分空泡变性，部分上皮刷状缘脱落，细胞扁平，间质未见显著改变。

对照组48 h，肾小球毛细血管轮廓模糊，小管上皮广泛的中、重度变性，可见数个小灶状小管坏死。

实验组48 h，肾组织结构改变轻微，可见轮廓清晰的肾小球、肾小管，除少量肾曲管轻度浊肿外，大部 分肾曲管结构正常，详见图1。

图1 肾组织切片HE染色Fig.1 HE staining of histologic sections(200×)

2.2 电镜检查结果

0～24 h肾组织电镜图像基本一致。但48 h后，普通低温保存的肾脏出现较明显的形态学改变，肾小管及肾小球的基膜厚度不均一。细胞内褶明显减少且紊乱。肾小管个别上皮细胞核出现核固缩，核缘呈锯齿状。线粒体基质的电子密度明显减低，嵴数量减少且排列紊乱，尤以近曲小管上皮更为显著。上皮细胞的改变比肾小球更为明显。

对照组48 h，核严重变形、核质固缩，核膜不规整，线粒体显著肿胀，嵴断裂、溶解明显，微绒毛分布散乱，大片脱落。

实验组48 h，核形大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，详见图2。

2.3 线粒体活性改变

随着低温保存时间延长，持续机器灌注组和普通低温保存组肾皮质线粒体功能均明显降低。保存12～48 h，普通低温保存组Ⅲ态呼吸呼吸耗氧速率下降明显且显著低于持续机器灌注组(P＜0.05)。48 h普通低温保存组较持续机器灌注组Ⅳ态呼吸耗氧显著增加(P＜0.05)，余时间点2组间比较差异无统计学意义(P＞0.05，图3);48 h持续机器灌注组较普通低温保存组皮质RCR、P/O显著增高，余时间点2组间比较，差异无统计学意义(图4)。

3 讨论

器官保存是器官移植学的三大技术支柱之一。理想的保存方法能为离体器官提供适宜的微环境，最大限度地延长器官保存时间，一直是器官移植领域研究的热点［3］。迄今为止，大多数移植中心仍旧优先采用静止的冷藏保存方法。冷藏保存的原理是应用低体温来降低代谢，通过冲洗器官的血液代之以保存液［4］。机器灌注在冷藏保存常规应用之前就已经得到了发展。机器灌注的原则是应用可控的连续性或者脉冲式的保存液循环来消除毒性代谢产物，提供营养和氧分。理论上讲，机器灌注能够保护，至少是部分保护器官不受缺血再灌注损伤，因此可以改善移植器官的质量［5］。机器灌注的原理是模拟器官在体内的环境，使通过器官的流体不中断，进而来保护器官。其机制目前仍旧不十分清楚。低体温机器灌注能够降低基础代谢，因此减少氧和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的消耗。灌注液的循环是通过管道器械装置来达到连续性或者脉冲式的循环流动。机器灌注至少在理论上能够提供连续性的营养和氧分，并且使得毒性代谢产物和自由基能够被清除掉。机器灌注还能够通过应用实时的药物和基因治疗来改善器官的质量［6］。此外，机器灌注还能够减少血管痉挛并且提供流体和阻力等参数来评估器官的性能，这对生理条件下脉管的功能保护是非常重要的［7］。

图2 电子显微镜图像Fig.2 Electron microscope images(1 000 ×)

图3 肾皮质线粒体呼吸Ⅲ、Ⅳ态耗氧速率改变Fig.3 Changes in oxygen consumption rates of state Ⅲ and Ⅳ respirations in renal cortex mitochondria

图4 肾皮质线粒体功能变化Fig.4 Changes in mitochondrial function of renal cortex

研究［8］表明，在低温保存中加强对线粒体功能的保护，能明显减轻低温缺血/再灌注损伤，提高器官保存效果。而线粒体通透性转变(mitochondrial permeability transition，MPT)是低温保存期间和再灌注后细胞凋亡和坏死信号转导途径中的关键事件。因此本实验把低温保存期间线粒体形态功能改变作为反映保存效果的重要指标。线粒体Ⅲ态呼吸反映ADP对呼吸链活性的控制，Ⅳ态呼吸反映无ADP存在的情况下呼吸链耗氧速率，RCR反映线粒体结构完整性及整体功能，P/O则反映其氧化释放能量转化为ATP的效率。上述指标常用于器官低温保存中监测细胞损伤［9-10］。随低温缺血损伤加重，普通低温保存组皮质线粒体Ⅲ态呼吸耗氧速率下降，导致RCR、P/O明显低于持续机器灌注组。这说明持续机器灌注对线粒体低温缺血损伤的保护作用比普通低温保存强。2组多个时间点Ⅳ态呼吸耗氧增加可能与呼吸链解偶联后，线粒体为维持自身膜电位病理性耗氧增加有关。研究［11］发现，脉冲式灌注与血流依赖的脉管内皮基因的表达相关。在这些基因中KLF2(Kruppellike factor 2)可能通过抑制前炎性反应、减少固有免疫系统的活化而在保护内皮方面发挥重要的作用［12］。尽管如此，目前机器灌注的机制仍旧不十分明了。

总之，随着使用边缘器官的增多，持续机器灌注的应用必将得到进一步的推广和广泛应用。而对于机器灌注保存，随着其机制的不断被发现，必将会更好的达到保护供体器官的目的。

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