西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF-7/ADR细胞的耐药性研究

季 恒，葛如意，王德全，梅文杰，黄海波，周俊立，郑士杰，石永超，汪保国，陈思东

0 引 言

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗物后可产生对此种化疗药物耐药性，而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。多柔比星(Doxorubicin)是乳腺癌化疗的常用药物，乳腺癌细胞的对多柔比星产生耐药是多柔比星化疗失败的主要原因［1］，也是影响临床肿瘤患者预后的重要因素［2］。乳腺癌是排名第一的女性常见恶性肿瘤，寻找克服乳腺癌MDR的药物或方法成为当前肿瘤研究的热点［3］。目前研究发现MDR的有效抑制剂有维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素［4-6］等，但这些耐药逆转剂干扰传统的抗癌药物药代动力学，且由于可引起严重的毒副作用等，至今都未取得预期的临床效果，因此在临床上被限制使用。寻找低毒高效且与合用的抗肿瘤药物无药动学交互作用的抑制剂，以提高药物的利用度，避免和降低药物的不良反应在指导临床抗肿瘤个体化治疗方面具有重要意义，同时也是当前肿瘤耐药性研究中的重要发展方向。

西地那非(Sildenafil)，又译昔多芬，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发现的治疗男性勃起功能障碍药物。已有研究发现5型磷酸二酯酶抑制剂西地那非［7］和伐地那非［8］能逆转 P-gp蛋白介导的MDR。同时也有研究发现西地那非和伐地那非可逆转MDR相关蛋白7(MRP7)介导的紫杉醇耐药［9］。本研究所用药物是西地那非的同系物，由本实验室指导广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物，拥有独立的知识产权。本研究旨在通过观察药物处理后MCF-7/ADR和MCF-7细胞株的生长抑制率、Rhodamine123浓度，探讨西地那非同系物体外实验的安全性极其逆转乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药性的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 实验所用MCF-7和MCF-7/ADR细胞株由中山大学附属肿瘤医院惠赠;其中MCF-7/ADR细胞株是通过浓度递增的多柔比星反复间歇诱导获得，对多柔比星耐药，而MCF-7细胞则为敏感细胞株。

1.2 药物和器材 本研究所用药物是由广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物，化学物结构式见图1(自编号XDNF1-0425和XDNF8-0113)，其电喷雾质谱(ESI-Ms)分别为m/z412.3(［M+H］+)和m/z331.3(［M+H］+);西地那非单体由圣约翰大学陈哲生教授惠赠;多柔比星、MTT、Rhodaminel23均购于美国Sigma公司，DMEM培养基购于美国Hyclone公司，倒置显微镜为日本Nikon公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.3 细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/ADR于含10%胎牛血清和青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 U/mL)的DMEM培养液中常规培养(37℃、5%CO2)。实验前在无药培养基中培养2周。细胞隔日换1次培养液，每隔3、4天传代1次。

图1 XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非结构图Figure 1 Structural formulas of XDNF1-0425，XDNF8-0113 and sildenafil

1.4 MTT法检测细胞毒性实验

1.4.1 MTT 法［10］测定2种西地那非同系物体外实验的安全浓度 取对数生长期MCF-7和MCF-7/ADR细胞进行种板(8000细胞/孔)，CO2的培养箱培养24 h后分别加入不同浓度的XDNF1-0425和XDNF8-0113(1、10、100、1000 μmol/L)，不加药物的为阴性对照组，只加培养基的为调零组，每组设3个复孔;继续培养68 h后加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培养4h后酶标仪(波长570nm)检测吸光值(A)，并绘制药物浓度与细胞生存率曲线图。

细胞生存率 =A加药组/A对照组×100%

1.4.2 MTT法测定2种西地那非同系物对MCF-7/ADR耐药的逆转作用 采用上述方法将准备好的MCF-7和MCF-7/ADR细胞分组种板，每组设3个复孔。24 h后加药，共分5组:①只加培养基的调零组;②不加药物只加细胞的阴性对照组;③多柔比星组:按浓度梯度分别加入多柔比星(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μmol/L)，每孔 10 μL;④多柔比星+药物组:XDNF1-0425和XDNF8-0113分别以无毒剂量(2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)与多柔比星共同加入;⑤多柔比星+西地那非组:不同浓度的西地那非(2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)与多柔比星共同加入。CO2的培养箱继续培养68 h后常规MTT比色法测定和记录各孔A值，并计算抑制率、半抑制率(IC50)以及逆转倍数。IC50通过线性回归分析计算，细胞抑制率和逆转倍数公式计算如下:

1.5 细胞内Rhodamine123累积实验 取对数生长期MCF-7和MCF-7/ADR细胞种于6孔板加入不同浓度 XDNF1-0425 和 XDNF8-0113(10.0、20.0 μmol/L)，CO2的培养箱孵育24h后收获。用胰酶制成细胞悬液并分组装致8个离心管:①调零组(只加细胞悬液);②阴性对照组(细胞中只加入含有10 mg/mL 的 Rhl23);③XDNF1-0425(10 μmol/L)+Rhodamine123 组;④ XDNF1-0425(20 μmol/L)+Rhodamine123 组;⑤XDNF8-0113(10 μmol/L)+Rhodamine123 组;⑥ XDNF8-0113(20 μmol/L)+Rhodamine123 组;⑦西地那非(10 μmol/L)+Rhodamine123组;⑧西地那非(20 μmol/L)+Rhodamine123组;各组细胞在37℃条件下振荡温育60 min，离心后预冷PBS洗涤细胞2遍，流式细胞仪测定细胞内平均荧光强度(mean fluorescence intensity)，Ex 488nm，Em 530 nm，检测药物对细胞内Rhodamine 123含量的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，定量数据以均数±标准差(±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析，两两组间多重比较用LSD检验，仅对两组均数的比较用Student's t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2种西地那非同系物的安全浓度 测定XDNF1-0425和 XDNF8-0113对细胞株 MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性作用，结果见图2。XDNF1-0425和XDNF8-0113对细胞株的IC50均＞100 μmol/L，在20 μmol/L浓度时细胞存活率均＞90%，因此后续实验选用2.5、5、10 和20 μmol/L 4 个浓度的XDNF1-0425和XDNF8-0113对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药性的逆转作用。

图2 XDNF1-0425和XDNF8-0113对细胞株 MCF-7和MCF-7/ADR的生长抑制作用Figure 2 Inhibitory effects of DNF1-0425 and XDNF8-0113 atdifferentconcentrations on MCF-7 and MCF-7/ADR cells

2.2 XDNF1-0425和 XDNF8-0113对 MCF-7/ADR耐药的逆转作用 MTT结果显示在单独加入多柔比星的对照组中MCF-7和MCF-7/ADR2种细胞株的 IC50分别为(0.15 ±0.08)μmol/L 和(17.63 ±1.73)μmol/L，可见 MCF-7/ADR 细胞对多柔比星耐药(耐药倍数为117.5);XDNF1-0425各浓度组干预后多柔比星对MCF-7/ADR细胞的IC50分别下降至(13.05 ±0.56)、(7.80 ±1.57)、(2.77 ±0.77)、(1.49 ±0.69)μmol/L，多柔比星对 MCF-7/ADR细胞的IC50在多柔比星+XDNF1-0425各浓度组较多柔比星组明显下降，有统计学意义(P＜0.05或 P ＜ 0.01)，逆转倍数为分别为 1.35、2.26、6.36和11.83倍，见表1。但多柔比星对MCF-7细胞的IC50与XDNF1-0425的加入与否其差异无统计学意义(P＞0.05);XDNF8-0113各浓度组干预后所得的IC50值与单用多柔比星组比较有明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)，逆转倍数为分别为 1.04、2.09、5.58、13.47 倍，见表 1。研究表明XDNF1-0425和XDNF8-0113能有效逆转MCF-7/ADM细胞对多柔比星的耐药性，且在一定浓度范围内XDNF1-0425和XDNF8-0113的浓度与逆转效果成正比。作为对照组单用西地那非与多柔比星处理后逆转倍数为分别为3.72、8.26、15.44、24.83 倍。

表1 XDNF1-0425和XDNF8-0113逆转MCF-7/ADR细胞对多柔比星的耐药性(±s，μmol/L)Table 1 Effects of sildenafil homologues on the sensitivity of MCF-7 and MCF-7/ADR cells to Doxorubicin(±s，μmol/L)

表1 XDNF1-0425和XDNF8-0113逆转MCF-7/ADR细胞对多柔比星的耐药性(±s，μmol/L)Table 1 Effects of sildenafil homologues on the sensitivity of MCF-7 and MCF-7/ADR cells to Doxorubicin(±s，μmol/L)

与多柔比星组比较，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

IC组 别50逆转倍数多柔比星组MCF-7/ADR 17.63 ±1.73 1.00多柔比星+西地那非组2.5 μmol/L 4.74 ±1.04＊＊ 3.72 5.0 μmol/L 2.13 ±0.97* 8.26 10.0 μmol/L 1.14 ±0.77* 15.44 20.0 μmol/L 0.71 ±0.69＊＊ 24.83多柔比星+XDNF1-0425组2.5 μmol/L 13.05 ±0.56＊＊ 1.35 5.0 μmol/L 7.80 ±1.57* 2.26 10.0 μmol/L 2.77 ±0.77* 6.36 20.0 μmol/L 1.49 ±0.69＊＊ 11.83多柔比星+XDNF8-0113组2.5 μmol/L 16.48 ±0.86* 1.04 5.0 μmol/L 8.24 ±1.23＊＊ 2.09 10.0 μmol/L 3.09 ±0.91* 5.58 20.0 μmol/L 1.28 ±0.44＊＊13.47

2.3 细胞内Rhodamine123累积实验 Rhodamine 123是一种特异性的P-gp蛋白荧光底物，通过细胞内Rhodamine 123的蓄积来反映药物抑制P-gp蛋白活性的效率，表现为测得的细胞内荧光强度。经 10 和 20 μmol/L XDNF1-0425 和 XDNF8-0113处理后的MCF-7/ADR细胞，Rhodamine l23荧光波峰右移，见图3，且在一定浓度范围内 XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非能够抑制MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123的外排，见表2;提示XDNF1-0425和XDNF8-0113可抑制MCF-7/ADR细胞P-gp蛋白的外排功能，增加Rhodamine 123在细胞内的蓄积。

图3 流式细胞术检测细胞内Rhodamine 123荧光强度Figure 3 Rhodamine 123 retention analyzed by FCM

表2 MCF-7/ADM细胞中不同浓度西地那非及其同系物对Rhodamine 123外排的抑制作用(±s)Table 2 Inhibitory effects sildenafil and its homologues on rhodamine 123 efflux in MCF-7/ADM cells(±s)

表2 MCF-7/ADM细胞中不同浓度西地那非及其同系物对Rhodamine 123外排的抑制作用(±s)Table 2 Inhibitory effects sildenafil and its homologues on rhodamine 123 efflux in MCF-7/ADM cells(±s)

外排抑制率=(经药物处理的荧光强度-阴性对照组的荧光强度)/阴性对照组的荧光强度×100%与阴性对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01

组 别 平均荧光强度(n=3) 外排抑制率(%)2.14 ±0.15 -XDNF1-0425组10.0μmol/L 2.53 ±0.09 18.35±2.31*20.0μmol/L 2.74 ±0.17 27.83±1.43＊＊XDNF8-0113组10.0μmol/L 2.49 ±0.24 16.67±0.57＊＊20.0μmol/L 2.77 ±0.09 29.48±1.93*西地那非组10.0μmol/L 2.57 ±0.35 20.21±0.94＊＊20.0μmol/L 2.97 ±0.15 38.57±2.86阴性对照组＊＊

3 讨 论

MDR是目前影响肿瘤患者化疗成功的一个主要因素，随着对MDR现象及其机制的不断深入研究，发现MDR的产生不是由单一因素引起的，而是多种机制共同参与作用的结果，包括肿瘤细胞凋亡逃避、DNA损伤后修复能力增强、抗癌药物作用分子靶点发生改变、抗癌药物代谢酶活性增强［11］、药物摄取降低以及进入内药物被主动转运到细胞外［12］等。近年来，关于天然提取物对肿瘤细胞MDR的研究成为热点，国外有学者使用米非司酮(Mifepristone)对卵巢癌耐药细胞株进行体外细胞毒性试验，结果发现5 μmol/L的米非司酮对细胞生长无影响，但使用该剂量的米非司酮能成功逆转该细胞对多种抗癌药的耐药性［13］。本次实验经过预实验发现10.0 μmol/L 和 20.0 μmol/L 浓度的西地那非同系物的逆转效果较好。Elizabeth和Alica［14］在米非司酮对耐多柔比星人乳腺癌细胞MCF-7/ADR体内外耐药逆转作用中试验中测得MCF-7/ADR细胞的耐药倍数为41倍。本实验中MCF-7/ADR细胞的耐药倍数为117.5倍，说明不同实验当中建立的耐药细胞体系存在较大差异，可能是由于原代细胞株对化疗药的敏感性不同和所用药物抗癌效力不同导致。本实验中 XDNF1-0425 在 10.0 μmol/L 和20.0 μmol/L时与多柔比星合用时MCF-7/ADR的逆转倍数分别为6.36和11.83倍;而XDNF8-0113在10.0 μmol/L 和 20.0 μmol/L 时与多柔比星合用时对MCF-7/ADR的逆转倍数为5.58和13.47倍，提示XDNF1-0425和XDNF8-0113具有较好的逆转作用;且在一定浓度范围内 XDNF1-0425和 XDNF8-0113的逆转效果随浓度的增高而增强。同时作为对照组的西地那非也具有较强的逆转效果，其在10.0 μmol/L 和 20.0 μmol/L 时与多柔比星合用时对MCF-7/ADR的逆转倍数为15.44和24.83倍;虽然本实验所用西地那非同系物的逆转倍数小于西地那非，但是其较小的副作用作为抗肿瘤细胞多药耐药的逆转剂仍然具有很重要的临床意义。

实验所选的人乳腺癌MDR细胞株MCF-7/ADR高表达P-gp蛋白［15］，P-gp蛋白是一种 ATP依赖性的跨膜外流泵，它可通过细胞膜转运多种抗肿瘤药，从而限制这些抗肿瘤药进入细胞而导致肿瘤细胞耐药，因此介导肿瘤细胞多柔比星、长春新碱等药物的耐药［16］。我们推测 XDNF1-0425和 XDNF8-0113逆转作用机制可能是抑制P-gp蛋白介导的细胞外排作用，并通过流式细胞术证实10.0 μmol/L和20.0 μmol/L 的 XDNF1-042 和 XDNF8-0113 可以抑制MCF-7/ADR细胞P-gp蛋白的外排功能，从而实现逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性。

综上所述，人乳腺癌MCF-7/ADR细胞对多柔比星耐药，而西地那非同系物XDNF1-0425和XDNF8-0113对其耐药性有显著的逆转作用，并且可抑制其P-gp糖蛋的外排功能。其逆转作用在蛋白表达及基因调控方面的具体机制还有待进一步的研究。

［1］ Detwiler A，Bloom P，Petersen A，et al.Multi-drug and methicillin resistance of staphylococci from canine patients at a veterinary teaching hospital(2006-2011)［J］.Vet Q，2013，32(2):60-67.

［2］ 陈一天，封 冰，陈龙邦.小细胞肺癌化疗耐药研究进展［J］.医学研究生学报，2012，25(5):515-519.

［3］ 赵善鹏，于泽平，顾 军，等.乳腺癌组织中BRCA1的蛋白表达与乳腺癌的相关性分析研究［J］.医学研究生学报，2011，24(10):1049-1053.

［4］ Goncalves RS，Kaiser CR ，Lourenco MC，et al.Mefloquine-oxazolidine derivatives，derived from mefloquine and arenecarbaldehydes:In vitro activity including against the multidrug-resistant tuberculosis strain T113［J］.Bioorg Med Chem，2012，20(1):243-248.

［5］ Zhang Z，Liu Z，Ma L，et al.Reversal of multidrug resistance by mitochondrial targeted self-assembled nanocarrier based on stearylamine［J］.Mol Pharm，2013，10(6):2426-2434.

［6］ Zhang LH，Wei EQ.ONO-1078 reduces NMDA-induced brain injury and vascular celladhesion molecule-1 expression in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(4):435-440.

［7］ Shi Zhi，Tiwari AK，Shukla S，et al.Sildenafil reverses ABCB1 and ABCG2-mediated chemotherapeutic drug resistance［J］.Cancer Res，2011，71(8):3029-3041.

［8］ Ding PR，Tiwari AK，Ohnuma S，et al.The phosphodiesterase 5 inhibitor vardenafil is a potent inhibitor of ABCB1/P-glycoprotein transporter［J］.PLoS One，2011，6(4):e19329.

［9］ Chen JJ，Sun YL，Tiwari AK，et al.PDE5 inhibitors，sildenafil and vardenafil，reverse multidrug resistance by inhibiting the efflux function of multidrug resistance protein7(ATP-binding Cassette C10)transporter［J］.Cancer Sci，2012，103(8):1531-1537.

［10］ 唐 琛，韩 克.性激素与促性腺激素对卵巢癌SKOV3细胞体外生长调控及其机制的研究［J］.医学研究生学报，2012，25(12):1238-1241.

［11］ 罗春英，王 璇，时姗姗，等.非小细胞肺癌化疗药物敏感基因表达及其临床病理特征分析［J］.医学研究生学报，2013，26(5):481-484.

［12］ Kuang YH，Shen T，Chen X，et al.Lapatinib and erlotinib are potent reversal agents for MRP7(ABCC1)-mediated multidrug tesistance［J］.Biochem pharmacol，2010，79(2):154-161.

［13］ Carbonell Esteve JL.Aeosta R，Heredia B，et al.Mifepristone for thet treatment of uterinel leiomyonms:a randomized controlled trial［J］.Obstet Gynecol，2008，112(5):1029-1036.

［14］ Elizabeth MF，Alica AG.Sistance to cisplatin does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to mifepristone eytotoxieity［J］.Cancer Cell International，2009，9(4):1-13.

［15］ Carson SW，Ousmanou AD，Hoyler SL.Emerging significance of P-glycoprotein in understanding drug disposition and drug interactions in psychopharmacology［J］.Psychopharmacol Bull，2002，36(1):67-81.

［16］ Ma H ，Miao X ，Ma Q，et al.Functional roles of glycogene and N-glycan in multidrug resistance of human breast cancer cells［J］.IUBMB Life，2013，2(31):108-123.