淡水石斑鱼胚胎发育观察

何杰

（ 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏无锡214081）

孙兴驰，隋东海

（南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡214081）

淡水石斑鱼（Cichlasoma managuense）隶属鲈形目（Perciformes）鲡鱼科（Cichlaidae）丽体鱼属（Cichlasoma），原产于中美洲，属名贵鱼类，1988年引入台湾，1996年从台湾引入大陆，成为淡水养殖的一个新品种［1］。目前，淡水石斑鱼在重金属毒性试验［2－3］、含肉率和肌肉营养成分分析［4］、血细胞发生的观察［5］、人工繁殖［6］、养殖［7－8］及病害防治［9］等方面已有一些研究，但其胚胎发育尚未见报道，而且丽体鱼属中也未见有胚胎发育方面的报道，但鲡鱼科中尼罗罗非鱼（Oreochrimis nilotica）［10－12］、莫桑比克罗非鱼（Oreochrimis mossambca）［13］、盘丽鱼（Symphysodon discus ）［14］、神仙鱼（Pterophyllums carale）［15］的胚胎发育均有报道。本研究探讨了淡水石斑鱼胚胎发育的特征，以为鱼苗的繁殖培育、品种改良提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 亲鱼的来源及培育

2010年6月从福建漳州购入一批淡水石斑鱼水花，在淡水渔业研究中心宜兴实验基地养殖，2012年5月从越冬池中选择个头较大、身体强壮的雌雄鱼各100尾，雌雄分开在温室内进行强化培育。

1.2 亲鱼的挑选及人工催产

在7月初，挑选腹部发白、膨大明显、颜色较淡的雌鱼和体色鲜艳、身体强壮的雄鱼，单尾重300～400g。在温室内进行人工繁殖，20：00时注射催产素，雌鱼每千克体重注射脑垂体1.5～3mg＋HCG 800～1000IU；雄鱼剂量减半。注射后的雌、雄亲鱼用网箱分开放，池内充气增氧，DO为8mg／L左右，水温28℃。清晨5：00时，将4尾雌鱼、6尾雄鱼放入同一只网箱，让其自然交配。此时，留人静候观察，发现雌鱼产卵受精时开始计时，进行胚胎发育观察。淡水石斑受精卵呈粘性，成片附着在网箱的网片上，刚产出为白色，遇水不久变为光泽的水色。结果交配的3只网箱，均有产卵。

1.3 样本取样和观察

在水面下向网箱内轻折附有受精卵的网片时有许多卵粒脱落，用洁净培养皿取得脱落卵粒，然后在Olympus生物显微镜下观察胚胎发育，并连接电脑放大成像。轻轻晃动培养皿，立体观察，详细记录不同时间的发育特征，同时进行显微摄影。观察环境水温（25.7±0.3）℃，每2h换水1次以保持胚胎正常发育。

2 结果与分析

在水温（25.7±0.3）℃的环境中，淡水石斑鱼的胚胎发育从受精卵开始至早期鱼苗，历时达56h，其中的35个阶段显著特征详见表1。其胚胎发育过程可划分为8个时期：胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、出膜期、卵黄期。

表1 淡水石斑鱼胚胎发育期及其特征

2.1 胚盘形成期

淡水石斑鱼受精卵为椭圆形，短轴（1.19±0.11）mm，长轴（1.51±0.13）mm，半透明，卵黄囊占据绝大部分体积，可见卵黄颗粒，动物极浅红色（图1－1）。受精几分钟后，动物极颜色逐渐变深同时隆起形成胚盘（图1－2），至32min后，胚盘高度不再变化并积累营养物质为卵裂作好准备（图1－3）。

2.2 卵裂期

受精后41min，卵裂开始发生，仅在动物极的胚盘正中央出现直线状淡色沟，并逐渐加深，胚盘一分为二（图1－4），然后两侧分别收缩并隆起，至1h9min时，形成2个大小均一馒头状细胞，完成第1次卵裂（图1－5）；第2～4卵裂与第1次分裂方向垂直。至1h20min完成第2次分裂，形成形状大小一致的4个分裂球进入4细胞期（图1－6）；分裂球的中部逐渐形成缢痕，至1h47min完成第3次分裂，形成8个形状大小基本一致的分裂球进入8细胞期（图1－7）；第4次出现不同步分裂，有的细胞已分开，有的还连接在一起，形状大小也产生差异，至2h2min完成第4次分裂进入16细胞期（图1－8）；至2h19min完成第5次分裂，进入32细胞期，细胞分裂呈不规则两层，细胞大小也不尽相同（图1－9）；至2h48min细胞又完成第6次分裂，细胞显著减小，进入64细胞期（图1－10）；细胞越分越细，位于中央部分细胞分裂较快，长方形细胞团变成半球形，至3h14min进入多细胞期（图1－11）；细胞分裂至3h49min时，细胞密集但仍可见单个细胞，随后分裂细胞团四周收缩，高度逐渐增加，进入桑葚期（图1－12）。

2.3 囊胚期

受精后4h55min进入囊胚期，细胞分裂更细，难以见到单个细胞，层数不断增加叠起，最终呈僧帽状的高囊胚期（图1－13）；接着僧帽状边沿向下铺展，囊胚细胞向四周延伸，囊胚高度逐渐降低，至5h57min类似早期胚盘（四周与卵黄交界处有亮环而与胚盘相异），进入平囊胚期（图1－14）。

2.4 原肠胚期

受精后7h16min进入原肠胚早期，囊胚细胞开始从动物极下包植物极，可见囊胚腔和早期胚环（图1－15），下包至1／5处时胚环显著，囊胚腔缩小（图1－16）；至8h23min下包至1／2处，形成原肠胚中期，可见胚盾，胚盾始于动物极止于胚环（图1－17）；在继续下包过程中，胚环形成的缢痕逐渐加深，胚盾显著增粗并与胚环一起下移并延伸（图1－18），至9h48min下包至2／3处，胚盾颜色开始转淡，下包过程中卵黄囊被挤而部分凸出胚环外，进入原肠胚后期（图1－19）；至10h50min下包至4／5，进入原肠胚末期，卵黄囊小部分被挤而突出形成泡状（图1－20）。

2.5 神经胚期

受精卵发育至11h47min时出现神经胚，胚体头部增高，出现脑泡，初现胚体轮廓，卵黄囊即将被包完，部分卵黄凸出似脱痣状卵黄栓（图1－21）；发育至11h52min，胚孔即将封闭，呈火山状，胚体头前端有细管连接。胚体索状，向外凸出卵膜外成脊，向内挤压卵黄囊成沟（图1－22）；至13h19min，神经胚头端抬起，出现体节，黑色素开始大量出现，体节延伸到植物极底端（图1－23）。

2.6 器官形成期

2.6.1 泡形成期

受精后16h23min，尾部出现透明小泡，介于卵膜与卵黄囊之间，体节较粗壮，视芽（视泡前身）可见（图1－24）；至21h11min，胚体扭动，胚尾扭转，挣脱膜的束缚，在卵膜与卵黄囊之间露出游离空间（图1－25），进入尾芽期；至23h9min，胚体头部两侧出现隆起形成泡状，进入视泡期（图1－26）；至27h43min，视泡后出现较小泡状物为听泡，此时胚体头前端有一小管连接，可见管内流动淡红色液体（图1－27）。至30h36min出现脑泡，胚体头部初具鱼苗头部轮廓，卵黄囊上开始出现黑色素颗粒（图1－28）。

2.6.2 心脏期

受精后34h29min为心脏前期，出现透明状管泡状物即心芽，胚体头前端管状物粗大，管内液体流动速度很快不易察觉，动物极下的卵黄过分吸收具明显缺刻（图1－29、图1－30），胚体头部进一步发育体积增大近1倍（图1－30）；至38h37min，可见圆环形晶体轮廓（图1－31），晶体环由不同的弧形小片组成；至38h56min为心脏中期，胚体头前端管膨大呈囊状，镶嵌于卵黄囊上，可见有液体从卵黄囊四周流向胚体头部（图1－32，1－33）；至43h26min，胚体异常活跃有力，胚体长度为此时卵径周长的3／4，在卵黄囊与卵膜之间间歇性摆动4～5秒扭动1次，卵黄囊被挤压呈不同形状（图1－34）；至47h 39min为心脏后期，心脏跳动有力，心率为38，胚体头前端囊状管液体流呈红色（图1－35）。

2.6.3 血液循环期

受精后48h53min进入血液循环前期，囊状管向卵膜一端分出4分支小管，为血液流出方向，可见小管内有快速流动的血液（图1－36、1－37）；至49h58min为血液循环后期，可见囊状管向卵黄囊一端有4支粗管，为血液流入方向，小管内血液颜色较鲜艳，心率增加至53（图1－38、1－39）。

2.7 孵化出膜

受精后52h24min，胚体运动挤压卵黄囊，囊状管被埋入卵黄囊内，尾尖处卵膜首先瞬间爆裂，内容物和卵黄苗被弹出（图1－40）。至56h53min，为卵黄苗前期，鱼苗呈弯曲状，身体前部附着在卵黄囊上（图1－41）；至77h46min，为卵黄苗后期，鱼苗身体平直透明，游动有力，卵黄囊显著缩小（图1－42）。鱼苗孵出后会挤在一起尾部朝同一方向不断摆动，形成微环循水体，此后进入亲鱼护崽阶段。

3 讨论

淡水石斑鱼属分批产卵热带鱼类，在繁殖季节很难判断雌鱼体内卵子发育的成熟情况，繁殖前雌雄分开进行强化培育十分必要，否则人工繁殖较难获得成功。孵化水温对鱼苗繁殖具有重要意义，从48种鱼类平均温度和发育时间来看，平均温度增高，发育时间缩短［16］，如冷水性鱼类山女鳟（Oncorhynchus masou masou）低于4℃比8℃时的孵化时间要长30d［17］，淡水石斑鱼在水温26～29℃时，48h可孵出仔鱼［1］。本研究采用孵化水温近26℃，孵化时间为56h，孵化水温还有提升的空间。

淡水石斑鱼胚胎发育从第4次分裂起，分裂相细胞排列趋向紊乱，不如泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）［18］、胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）［16］等鱼类分裂细胞排裂整齐。受精卵外观和发育与同科的盘丽鱼胚胎发育较为近似［14］，与同科的罗非鱼相比，后者受精卵为卵圆形，动物极较尖，淡黄色不会遇水变得透明，发育过程中的血管系统也不如淡水石斑鱼发达［10－12］。

淡水石斑鱼胚胎发育形成了较为复杂的胚胎血液环循系统，其卵黄囊较软，胚环的下移和胚体的活动都能轻易改变其形状，这些特征与运动相关因此需氧量也相对较高，所以淡水石斑鱼胚胎发育耗氧较高，所以有亲鱼护卵习性，用鳍扇动水流，从而增加氧气，否则受精卵会发白，不久即死亡。

在心脏形成中、后期，胚体头部端管膨大成囊状，内部流动着无色液体也转化为淡血色至鲜红色，囊状物类似心脏，但无搏动现象，末起到心脏搏动提供动力作用，后来其发育去向不明，其原因还需要做进一步研究。同时在心脏中、后期和出膜前期，胚体也异常活跃，对环境条件的变化也比较敏感，通过观察发现，此阶段如从25.7℃降至18℃，出膜后的鱼苗出现水泡胸，不久死亡。幼苗破膜而出同时伴有大量的废物质释放，水质易恶化，所以在受精卵在出膜阶段，适宜的水温和丰富的溶氧有利于幼苗成活和正常发育。

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