柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌的实验研究

黄 艳，刘 鑫，廖端芳

(1.南华大学，湖南衡阳 421001;2.南华大学附属第一医院中医科，湖南衡阳 421001;3.湖南中医药大学，长沙 410208)

肺癌是严重危害人类健康的疾病之一，无论是发病率还是死亡率均居全球癌症首位，其中75% 为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。由于缺乏早期的诊断方法，大多数患者在诊断时已是局部晚期，即使完全切除仍有相当部分出现复发转移［1］。单纯手术治疗的5年生存率为20% ～25%［2］，单纯根治性手术获益亦有限［3］，即使有手术切除机会也有部分患者拒绝手术。放射疗法是晚期患者的主要治疗方法，但常规放疗疗效差，且其不良反应大，5年生存率仅为10%左右［4］。以内皮抑制素为主的新型联合放化疗虽能抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移，使肿瘤细胞凋亡且不产生耐药，但也有毒副作用［5］。近年来，中药在治疗非小细胞肺癌方面以其可靠的疗效显示出良好的趋势，柴胡龙牡汤在临床上治疗非小细胞肺癌有肯定的疗效［6］。本实验对柴胡龙牡汤治疗Lewis肺癌的作用和毒副反应进行了研究和观察。

1 材料与方法

1.1 药物

柴胡龙牡汤组成:柴胡12 g，黄芩15 g，法半夏15 g，党参10 g，茯苓20 g，合欢皮20 g，钩藤12 g，炒酸枣仁30 g，郁金15 g，生龙骨30 g，生牡蛎30 g，石菖蒲12 g，炙甘草8 g。药物煎煮2次，分别加10倍或8倍的水煎煮60 min或40 min，合并煎液过滤后浓缩至生药1.0 g/mL，置于4℃冰箱保存备用［7］。

1.2 动物

C57BL/6J近交系小鼠40只，鼠龄6周，体质量(20±2)g，SPF级雌雄各20只，购于北京维通利华实验动物有限公司(许可证号 SCXK(京)2006-0009，质量合格证编号0230988)。

1.3 试剂

Lewis肺癌细胞株(Lewis lung cancer cells)由中国协和医科大学细胞中心免疫实验室提供。MTT法试剂盒、ELISA法IFN-α试剂盒和ELISA法IL-10试剂盒由上海生物工程有限公司提供。

1.4 仪器

CHD型光学显微镜(日本 Olympus)，SpectraMax M5型酶标仪(美国 Molecular Devic)，Biofuge Stratos型低温高速离心机(德国heraeus公司)、产品图像采集及图像分析系统(美国BioRad)。

1.5 实验方法

实验小鼠适应性喂养1周后，在每只小鼠皮下注射培养Lewis肺癌细胞株0.2 mL，5 d后将造模成功的40只小鼠按随机数字表法分成柴胡龙牡组、模型组、顺铂放射组和恩度联合NP组4组。柴胡龙牡组小鼠给予柴胡龙牡汤400 mg/d(0.4 mL/d，含生药 0.4 g)［8］，模型组小鼠给予生理盐水 0.4 mL/d灌胃，顺铂化疗组实施顺铂治疗每天1 mg/kg，以上各组每天治疗1次，持续2周。恩度联合NP组于第1、8天长春瑞宾(NVB)25 mg/m2静脉推注，第1天顺铂(CDDP)80 mg/m2静脉推注，每天给予恩度15 mg静脉滴注。静脉滴注治疗结束后处死动物，取出肺脏的肿瘤组织，去除小鼠的肺组织进行称重，固定于4%的多聚甲醛中，观察计数每只小鼠肺组织转移结节的个数;取处于对数增殖期的Lewis肺癌细胞给予1∶100稀释的柴胡龙牡汤药汤，模型组、顺铂放射组、恩度联合NP组给予同样稀释度的生理盐水，分别于加药后0 d、1 d、2 d、3 d测量进行测量，测量之前，在每孔加 MTT50 μL(5 mg/mL)，于37℃、95%O2、5%CO2的培养箱孵育 4 h，加 150 μL DMSO，室温振荡10 min，酶标仪检测OD570的吸光度值;在小鼠脾淋巴细胞悬液中加入100 μL1640培养液(含ConA)，在50 mL/L二氧化碳浓度、37℃的培养箱条件下进行36 h的培养，取上清液用ELISA法测定IFN-γ和IL-10含量。

2 结果

2.1 给药前后小鼠质量的变化

表1显示，造模成功后给药2周，模型组质量没有明显变化，柴胡龙牡汤组质量较之前明显增加，差异有统计学意义;顺铂化疗对照组和恩度联合NP对照组实验动物质量明显减轻，差异有统计学意义。

表1 给药前后小鼠质量变化(±s)

表1 给药前后小鼠质量变化(±s)

注:与模型组比较:P＜0.05，柴胡龙牡汤组质量明显增加

组别 剂量(mg/d)样本数(n)给药前质量(g)给药后质量(g)R顺铂化疗对照组400 10 20.01 ±0.21 22.32 ±1.97 1.115 0.02 10 20.00 ±0.22 15.33 ±0.45 4.671恩 度 联 合 NP 对 照 组 15.00 10 19.54 ±0.25 16.01 ±0.33 3.820模 型 组 400 10 9.32 ±0.24 20.19 ±2.13 1.045柴胡龙牡汤组

2.2 4组实验动物肿瘤的质量变化

表2显示，以模型组为对照，柴胡龙牡汤组、顺铂化疗组、恩度联合NP组动物的肿瘤质量均明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明柴胡龙牡汤、顺铂化学治疗和恩度联合NP治疗均能抑制肿瘤组织的增殖。柴胡龙牡汤组的抑瘤率(36.9%)＜顺铂化疗组(45.7%)＜恩度联合NP治疗组(46.3%)，说明柴胡龙牡汤的抑制肿瘤功效小于顺铂治疗法和恩度联合NP治疗法。抑瘤率=(1－柴胡龙牡汤组肿瘤质量/模型对照组肿瘤质量)×100%。

2.3 3组实验动物肿瘤肺转移结节比较

表3显示，以模型组为对照，柴胡龙牡汤组、顺铂放射组和恩度联合NP治疗组动物的肿瘤肺转移结节数量均明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明柴胡龙牡汤和顺铂化学治疗均能抑制肿瘤肺组织的转移。柴胡龙牡组的转移抑制率(29.3%)＜顺铂放射组(44.6%)＜恩度联合NP治疗组(46.3%)，说明柴胡龙牡汤抑制肿瘤肺转移的功效小于顺铂化学疗法和恩度联合NP治疗法。肿瘤转移抑制率=(1－柴胡龙牡汤组平均每只小鼠肺转移结节个数/对照组每只小鼠肺转移结节个数)×100%。

表2 4组实验小鼠瘤重和抑瘤率(±s)

表2 4组实验小鼠瘤重和抑瘤率(±s)

注:与模型组比较:T=3.789，P=0.001，柴胡龙牡汤组肺肿瘤质量明显减少

组别 剂量(mg/d)样本数(n)出瘤情况(n)瘤重(g)抑瘤率(%)顺 铂 放 射 对 照 组0.02 10 9 1.61 ± 0.71 45.7恩 度 联 合 NP 对 照 组 15 10 10 1.57± 0.37 46.3模型组 400 10 10 2.88± 0.50 —400 10 10 1.82 ± 0.91 36.9柴胡龙牡汤组

2.4 柴胡龙牡汤和模型组细胞增殖能力比较

表4显示，柴胡龙牡汤组肺癌细胞的数量在第2天和第3天明显少于模型组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表3 柴胡龙牡汤对小鼠肺转移灶的影响(±s)

表3 柴胡龙牡汤对小鼠肺转移灶的影响(±s)

注:与模型组比较:T=2.268，P=0.032，柴胡龙牡汤组肺肿瘤转移灶/只明显减少

组别 剂量(mg/d)样本数(n)出现转移灶的样本(n)转移灶(个/只)转移抑制率(%)顺铂化疗对照组400 10 10 1.62 ±1.21 29.3 0.02 10 8 0.78 ±2.24 44.6恩 度 联 合 NP 对 照 组 15 10 7 0.72 ±2.12 48.2模 型 组 400 10 10 3.98 ±3.56 —柴胡龙牡汤组

表4 MTT检测2组处理对于细胞增殖能力的影响OD570，±s

表4 MTT检测2组处理对于细胞增殖能力的影响OD570，±s

注:*P＜0.05，表示加药处理后第2天和第3天柴胡龙牡汤组肺癌细胞数明显少于模型组

组别 剂量(mg/d)0 d 1 d 2 d 3 d模型组0.89 0.011 0.02 400 0.23 ±0.32 0.30 ±0.13 0.74 ±0.10 0.85 ±0.12柴胡龙牡汤组 400 0.23 ±0.33 0.28 ±0.22 0.32 ±0.13* 0.34 ±0.23*t—0.135 4.435 3.405 P—

2.5 3组实验动物血小板、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血红蛋白比较

表5显示，柴胡龙牡汤组的血小板红细胞、白细胞、血红蛋白和模型组、顺铂化疗组、恩度联合NP治疗组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，4组实验动物中性细胞比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表5 4组实验动物治疗前后的血小板、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血红蛋白比较(±s)

表5 4组实验动物治疗前后的血小板、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血红蛋白比较(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龙牡汤治疗后血小板红细胞、白细胞、血红蛋白与模型组、顺铂化疗组、恩度联合NP治疗组比较，柴胡龙牡汤组对上述指标无明显影响

组别 剂量(mg/d)样本数(n)时 间 WBC(×109/L)中性粒细胞(×109/L)Pt(×109/L)RBC(×1012/L)HGB(g/L)顺 铂 化 疗 对 照 组 0.02 10 治疗前 7.63 ±1.41 5.46 ±1.59 133.46 ±23.68 3.61 ±0.34116.31 ± 8.48治疗后 15.11 ±2.65 8.31 ± 5.29 60.82 ± 17.71 6.41 ±3.24 162.23 ±11.9恩度联合NP对照组 15 10 治疗前 7.98±1.23 5.68 ±1.48 137.23±21.65 3.67±0.58 116.22± 5.43治疗后 14.22 ±2.11 8.23 ±4.08 80.47 ±18.10 5.43 ±2.27 155.21 ± 9.79模 型 组 400.00 10 治疗前 8.32 ±1.71 5.64 ±1.76 134.35 ±18.33 3.71 ±0.85 116.17 ± 6.64治疗后 — — — —柴 胡 龙 牡 汤 组 400.00 10 治疗前 8.02 ±1.57 5.72 ±1.74 139.15 ±16.50 3.58 ±1.05 116.25 ± 4.78治疗后 4.29 ±1.69 3.15 ±1.23 100.38 ±16.94 4.01 ±0.87 115.57 ± 3.56*

2.6 各组小鼠脾上清液中自然杀伤细胞活性、脾上清液中IFN-γ和IL-10含量比较

表6显示，柴胡龙牡汤组小鼠脾上清液中自然杀伤细胞活性明显高于模型组和顺铂化疗组，差异有统计学意义(P＜0.05);柴胡龙牡汤组高于顺铂化疗组和恩度联合NP治疗组的脾上清液中IFN-γ含量，模型组明显更少，差异有统计学意义(P＜0.05);柴胡龙牡汤组小鼠脾上清液IL-10含量明显低于模型组、顺铂化疗组和恩度联合NP治疗组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.7 各组小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群的比较

表7显示，柴胡龙牡汤组脾脏T淋巴细胞的CD4+、CD4+/CD8+比值和模型组、顺铂放射组、恩度联合NP治疗组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，CD8+差异无统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨论

原发性支气管肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居各种恶性肿瘤之首，由于肿瘤的隐匿性和早期诊断方法的缺乏，导致大约2/3的患者在确诊时已属晚期［7］。目前晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治疗 NCCN指南推荐以放化疗联合为主的模式，其中一线标准治疗以4～6个周期含铂双联方案化疗为主 ，有效率仅20% ～40%，中位生存期8～10个月［9］，虽然可短时期内控制肿瘤的生长和转移，改善患者症状，但大部分患者在3～4个月后出现病情的进展与恶化。绝大多数抗肿瘤药物缺乏理想的选择性和靶细胞作用，因此在抑制肿瘤的同时，往往不同程度地影响机体正常组织细胞、中枢神经系统及重要脏器，影响患者生存质量，使许多患者难以接受和坚持化疗。化疗是不能手术患者和手术未能根治的患者的主要治疗方法［4］，单纯化疗疗效不令人满意，2年以上生存率仅为10% ～20%［10］。以上治疗方法失败的原因在与局部治疗的失控和(或)肿瘤的远处转移［11］。中医药在治疗晚期肺癌中发挥了独特的优势，它能延长患者生存期，改善生存状况且能增效解毒。目前已有很多种中药制剂应用于临床，如消积饮、长必安胶囊、十全大补汤、健脾益肺化瘀方、益肺抗瘤饮、槲皮素等。实验证实，它们都对小鼠的Lewis肺癌具有明显的抑制作用，其主要机理为抑制肿瘤细胞周期的DNA合成，影响Lewis肺癌细胞的基因表达，从而达到抑制肺癌细胞的分裂与增殖，纠正免疫微循环紊乱;影响肿瘤细胞凋亡而起到抑制肿瘤作用;抑制Lewis肺癌毛细血管生成，降低血管内皮细胞生长因子的表达，促使树突浸润成熟，微血管减少可导致肿瘤组织内缺血缺氧引起肿瘤细胞凋亡，由此减少由血行扩散而导致的肿瘤转移等［12］。目前中医认为，肿瘤的发生与气机升降失常有密切关系，可通过调理肝、脾、肾来减轻恶性肿瘤患者的临床症状，提高生质量。《素问·至真要大论》指出，疾病的治疗原则是“高者抑之，下者举之”、“疏其气血，令其条达，而致和平”，也就是调和阴阳、平衡气血。柴胡龙牡汤由小柴胡加龙骨牡蛎汤加减而成，具有理肝、化饮、调阴阳、和荣卫、助升降、和肝胆、镇惊止悸作用，临床多用于抑郁症的治疗，被认为是治疗郁症、惊悸怔忡、失眠、癫狂等神经系统疾病的主方之一。由于柴胡龙牡汤的调畅气机作用，则阴阳气血调和，以达“阴阳和则疾病自愈”的特殊作用，与肿瘤的部分机制相类似，因此有作者以此方治疗肺癌患者取得了较好的疗效［13］。

表6 各组小鼠自然杀伤细胞活性、脾上清液中IFN-γ含量、脾上清液中IL-10含量比较(±s)

表6 各组小鼠自然杀伤细胞活性、脾上清液中IFN-γ含量、脾上清液中IL-10含量比较(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龙牡汤组小鼠脾上清液自然杀伤细胞活性、小鼠脾上清液中IFN-γ含量及小鼠脾上清液中IL-10含量与模型组、顺铂化疗组、恩度联合NP治疗组比较差异有统计学意义

组别 剂量(mg/d)样本数(n)小鼠脾上清液自然杀伤细胞活性(%)小鼠脾上清液中IFN-γ含量(pg/ml)小鼠脾上清液中IL-10含量(pg/ml)0.02 10 14.68 ±2.05 50.71 ±10.09 148.51 ±29.41恩 度 联 合 NP 对 照 组 15.00 10 13.23 ±1.99 57.63 ±11.87 133.54 ±18.77模 型 组 400.00 10 19.36 ±0.02 49.51 ± 6.59 153.28 ±33.08柴 胡 龙 牡 汤 组 400.00 10 52.45 ±0.16 65.87 ±17.86 117.31 ±11.62顺铂化疗对照组*

表7 各组小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群的比较(±s)

表7 各组小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群的比较(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龙牡汤组CD4+、CD4+/CD8+的比值模型组、顺铂放射组、恩度联合NP治疗组比较差异有统计学意义

组别 剂量(mg/d)样本数(n)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+顺 铂 化 疗 对 照 组0.02 10 13.21 ±1.81 16.71 ±1.59 0.88 ±0.24恩 度 联 合 NP 对 照 组 15.00 10 15.18 ±1.87 16.62 ±1.03 0.93 ±0.17模 型 组 400.00 10 9.13 ±2.21 14.59 ±3.31 0.64 ±0.46柴 胡 龙 牡 汤 组 400.00 10 22.25 ±6.79* 15.52 ±4.45 1.41 ±0.36*

本实验结果发现，用柴胡龙牡汤组在减轻Lewis肺癌瘤体的质量、抑制肿瘤肺组织转移、降低肿瘤细胞的增殖能力方面与模型组比较差异显著，但与顺铂等化疗药物比较差异显著，提示柴胡龙牡汤在抑制肿瘤生长及转移方面不如化疗药物。这可能与中药的多靶点多途径而作用点不集中有关，也可能与实验周期短有关。而在提高脾脏的自然杀伤细胞活性和IFN-γ含量、降低脾脏中IL-10含量方面，与采用生理盐水治疗的模型组比较差异有统计学意义，也高于于顺铂化疗组和恩度联合NP治疗组。柴胡龙牡组T淋巴细胞的CD4+、CD4+/CD8+和模型组、顺铂放射组和恩度联合NP对照组比较差异显著。说明柴胡龙牡汤对Lewis肺癌的抑制作用，可能不是直接针对癌细胞，而是通过调整免疫、扶助“正气”并能够避免化疗带来的损伤正常免疫细胞和引起炎症反应的副作用，从而抑制肿瘤的生长转移，其具体作用机制有待进一步研究。

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