冷饭团的抗炎作用及其机制研究

李 艳，陈 骏，黎开燕，李文胜

(1．湖北省宜昌市夷陵医院，湖北 宜昌443100;2．湖北省宜昌市夷陵区医疗保险局，湖北 宜昌443100)

冷饭团为木兰科植物冷饭团Kadsura coccinea(Lem．)A．C．Smith的根及藤茎，产于湖北、四川等地，又名绯红南五味子、黑老虎等。其性味苦、温，有行气活血、消胀止痛之功效，民间常用于治疗风湿骨痛、跌打扭伤、妇女痛经、慢性胃炎等症［1］。冷饭团具有抗肝纤维化、抗氧化、抗血小板、抗HIV病毒、抗衰老等多种药理作用［2－3］，但对其抗炎作用的药理研究却少见报道。本研究对冷饭团的抗炎作用及其可能机制进行了实验分析，旨在为进一步开发利用冷饭团药用资源提供实验依据。

1 实验资料

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级SD大鼠，体质量(200±20)g，雄性;昆明种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄兼用。均由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(合格证号:SCXK2010－0007)。

1.1.2 试药 冷饭团藤茎采自夷陵区，切薄片，干燥，水煎2次，每次60 min，滤过，合并滤液，置水浴上浓缩至1 mL含生药0．15 g、0．3 g和0．6 g 3种浓度的水煎液。地塞米松磷酸钠注射液，湖北天药药业股份有限公司生产(批号:120516)。雷公藤多苷片，浙江普洛康裕天然药物有限公司生产(批号:20110924)，临用时用注射用水配制成0．5 g/L浓度的混悬液。弗氏完全佐剂(FCA)，美国Sigma公司产品。白细胞介素－1β(IL－1β)、肿瘤坏死因子 －α(TNF－α)和前列腺素E2(PGE2)试剂盒均由北京华英生物技术研究所提供，一氧化氮(NO)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司生产)，YLS－7A型足趾容积测量仪(济南益延科技发展有限公司生产)，SN－682型放射免疫γ计数器(上海核福光电仪器有限公司生产)，JA2003A型电子精密天平(上海精天电子仪器有限公司生产)，DL－8R型冷冻离心机(上海离心机械研究所生产)。

1.2 方法

1.2.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验 取健康小鼠50只，随机分为5组，即模型对照组、地塞米松组和冷饭团低、中、高剂量组，每组10只。各组小鼠均按10 mL/kg体质量的剂量灌胃给药，其中模型对照组灌服生理盐水，地塞米松组灌服0．5 g/L浓度的地塞米松磷酸钠溶液，冷饭团低、中、高剂量组分别灌服低、中、高浓度(1 mL 含生药 0．15 g、0．3 g 和 0．6 g)的冷饭团水煎液。每天给药1次，连续7 d。于末次给药后30 min，在每只小鼠的左耳前后两面均匀涂抹二甲苯0．1mL，右耳不做任何处理。60 min后将各组小鼠断头处死，沿耳廓基线剪下左右双耳，用直径9 mm的打孔器分别在左右两耳同一部位打下一圆耳片，用扭力天平称取耳片质量，以两耳片质量的差值为肿胀程度。

1.2.2 醋酸致小鼠毛细血管通透性增高实验 取健康小鼠50只，按1．2．1项下的方法分组和给药。于末次给药后60 min，每只小鼠均尾静脉注射0．5%伊文思蓝(Evans Blue)溶液10 mL/kg，随即腹腔注射0．6%醋酸溶液10 mL/kg。20 min后脱颈椎处死小鼠，每鼠腹腔注射生理盐水5 mL，并轻揉腹部0．5 min。5 min后剪开小鼠腹部皮肤肌肉，吸取腹腔洗涤液3 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清液于590 nm波长处测定吸光度值［4］。

1.2.3 大鼠棉球肉芽肿实验 取健康SD大鼠50只，腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，在无菌条件下，切开腹部皮肤，将已称质量的灭菌棉球分别植入大鼠两侧腹股沟皮下。术后每只大鼠肌肉注射2万IU青霉素，每天1次，共3次。将大鼠按1．2.1项下的方法分组和给药，每天1次，连续7 d。于末次给药后24 h处死大鼠，将植入的棉球连同周围结缔组织一起取出，除去脂肪组织。置60℃烤箱中烘烤至恒重，电子精密天平称取质量。将称得的质量减去棉球原质量即得肉芽肿质量(以mg/100 g体质量表示)。

1.2.4 大鼠佐剂性关节炎(AA)实验 取SD大鼠60只，随机分为正常对照组、模型对照组、雷公藤多苷组和冷饭团低、中、高剂量组，每组10只。各组大鼠经适应性饲养7 d后，均按10 mL/kg体质量的剂量灌胃给药，每天1次，连续27 d。其中雷公藤多苷组灌服0．5 g/L浓度的雷公藤多苷混悬液，冷饭团低、中、高剂量组分别灌服低、中、高浓度(1 mL含生药0．15 g、0．3 g 和 0．6 g)的冷饭团水煎液，正常对照组和模型对照组灌服等体积的生理盐水。除正常对照组外，其余各组大鼠于第3天给药后，在每只大鼠双后足的踝关节处做一标记线，用足趾容积测量仪测量每只大鼠左、右后足标记线以下的容积。将动物用乙醚浅麻醉，在每只大鼠的右后足趾部位皮内注射0．05 mL弗氏完全佐剂致炎。于致炎后第24小时和第4天，用致炎前相同的方法测量每只大鼠右后足标记线以下的容积，并于致炎后第16天和第24天同法测量每只大鼠左后足标记线以下的容积，计算各组大鼠左、右后足的肿胀率［5］。于末次给药后，各组大鼠禁食24 h，在乙醚浅麻醉下经腹主静脉采血，3 500 r/min离心10 min，取血清，－70℃下保存。将大鼠处死，从左后足踝关节上方0．5 cm处摘取肿胀足爪，纵向切开，放入5 mL冰冷的生理盐水中，置冷藏箱中浸泡过夜，将浸出液用冷冻离心机离心(3 500 r/min)10 min，取上清液，－70℃下保存。按照试剂盒说明书要求的步骤操作，采用放射免疫法测定血清IL－1β、TNF－α和关节浸液中PGE2的含量，以硝酸还原酶法测定关节浸液中NO含量，均由华中科技大学同济医学院附属同济医院测定。

2 结 果

2.1 各组动物耳廓肿胀程度、毛细血管通透性及板球肉芽肿程度比较 小鼠耳廓肿胀程度、毛细血管通透性增高及各组大鼠肉芽肿质量，地塞米松组和冷饭团低、中、高剂量组均明显低于模型对照组(P＜0．05或0．01)。见表1。

表1 各组动物耳廓肿胀、毛细血管通透性和大鼠棉球肉芽肿情况比较(±s)

表1 各组动物耳廓肿胀、毛细血管通透性和大鼠棉球肉芽肿情况比较(±s)

注:①与模型对照组比较，P ＜0．05;②与模型对照组比较，P ＜0．01。

组别 n 耳廓肿胀程度/mg 腹腔伊文思蓝吸光度值 肉芽肿质量/(mg/100)模型对照组10 28．73±6．26 1．36±0．23 16．07±3．21地塞米松组 10 13．59±3．36② 0．54±0．08② 8．79±2．19②冷饭团低剂量组 10 21．64±5．83① 0．83±0．12② 12．26±2．67①冷饭团中剂量组 10 19．10±4．57② 0．67±0．11② 11．92±2．46①冷饭团高剂量组 10 17．86±4．28② 0．62±0．14② 10．65±2．53②

2.2 各组AA大鼠足肿胀程度比较 大鼠经FCA致炎后，右后足出现关节炎症状，肿胀持续4 d后逐渐减轻。从致炎后第10天开始，大鼠左后足和前肢出现继发病变，肿胀持续至实验结束。致炎后第24小时和第4天大鼠右后足肿胀率比较，雷公藤多苷组和冷饭团低、中、高剂量组均明显低于模型对照组(P＜0．05或P＜0．01)。致炎后第16天和第24天大鼠左后足肿胀率比较，雷公藤多苷组和冷饭团中、高剂量组明显低于模型对照组(P＜0．05或P＜0．01)。见表2。

表2 各组AA大鼠后足肿胀率比较(±s，%)

表2 各组AA大鼠后足肿胀率比较(±s，%)

注:①与模型对照组比较，P ＜0．05;②与模型对照组比较，P ＜0．01。

组别 n右后足肿胀率致炎后24h 致炎后4d左后足肿胀率致炎后24h 致炎后4d模型对照组 10 56．93±12．37 51．54±10．87 49．37±11．06 47．16±9．89雷公藤多苷组 10 31．26±8．74② 29．75±8．13② 28．56±7．73② 27．59±5．46②冷饭团低剂量组 10 44．52±10．86① 40．31±9．67② 39．84±9．80 38．47±10．35冷饭团中剂量组 10 42．43±10．18② 39．51±8．97② 37．78±8．65① 36．49±8．16①冷饭团高剂量组 10 41．27±9．84② 36．87±8．28② 36．10±9．03① 35．85±8．59①

2.3 各组 AA大鼠血清 IL－1β、TNF－α和关节浸液中PGE2、NO含量比较 大鼠血清IL－1β和关节浸液中NO含量模型对照组明显高于正常对照组(P均＜0．01)，雷公藤多苷组和冷饭团中、高剂量组明显低于模型对照组(P＜0．05或P＜0．01)。各组大鼠血清TNF－α和关节浸液中PGE2水平模型对照组明显高于正常对照组(P均＜0．01)，雷公藤多苷组和冷饭团低、中、高剂量组明显低于模型对照组(P＜0．05或 P ＜0．01)。见表3。

表3 各组AA大鼠血清IL－1β、TNF－α和关节浸液中PGE2、NO含量比较(±s，n=10)

表3 各组AA大鼠血清IL－1β、TNF－α和关节浸液中PGE2、NO含量比较(±s，n=10)

注:①与模型对照组比较，P ＜0．05;②与模型对照组比较，P ＜0．01。

组别 IL－1β/(μg/L)TNF－α/(μg/L) PGE2/(μg/L) NO/(μmol/L)正常对照组 67．59±13．03② 21．43±5．89② 9．07±2．69② 20．94±5．67②模型对照组 140．23 ±29．84 58．17±13．72 26．59±7．25 46．70 ±11．21雷公藤多苷组 89．48±19．15② 33．76 ±9．34② 12．45±3．10② 28．36±7．52②冷饭团低剂量组 119．41 ±22．59 44．59 ±10．40① 18．76±5．51① 36．83 ±9．76冷饭团中剂量组 110．27±20．74① 40．85 ±9．56② 17．87±6．06① 34．57±9．09①冷饭团高剂量组 107．78±22．06① 39．22 ±9．87② 16．40±5．62② 33．72±8．78①

3 讨 论

炎症是机体活组织对各种损伤刺激所发生的以防御为主的反应，急性炎症表现为炎症部位红肿、毛细血管通透性增高而引起炎症渗出和组织肿胀等，在慢性炎症期则表现为巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，引起成纤维细胞增生形成肉芽组织［6］。本研究结果表明，冷饭团能明显抑制二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀、醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增高及棉球诱导的大鼠肉芽肿，说明冷饭团对急性炎症期的水肿和渗出及炎症晚期的组织增生和肉芽组织形成均有抑制作用。

类风湿关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病，主要临床表现为慢性、进行性、对称性及侵蚀性的外周关节破坏，可导致关节功能障碍，有较高的致残率［7］。在RA的发病过程中，Th细胞及其所分泌的细胞因子起着重要作用，细胞因子网络平衡失调可能是介导RA滑膜慢性炎症的发生和发展过程的主要因素［8］。RA病变中显著增高的炎性细胞因子主要是IL－1β和TNF－α，它们在整个病程中始终保持在较高水平，直接介导了关节的损伤和全身的炎症反应［9］。IL－1β和TNF－α还可相互诱生，刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞合成PGE2和胶原酶等炎性递质。PGE2能选择性抑制抑制性T细胞的功能，导致细胞功能亢进，分泌过多的抗体，引起组织器官损伤。局部高浓度的PGE2可导致软骨基质降解、软骨吸收和骨破坏，还可以共同作用于滑膜巨噬细胞，使其进一步分化为破骨细胞，导致关节局部滑膜炎症和软骨组织破坏［10－11］。NO可促进巨噬细胞合成释放 IL－1β、TNF－α 等细胞因子，导致滑膜及炎性细胞产生和释放的前列腺素增多，加重炎症反应。大鼠AA是一种发病机制和病理表现特征与人RA相接近的免疫性关节炎模型，是一种筛选和研究治疗RA药物常用的模型之一［12］。本实验采用FCA诱导AA模型，大鼠在致炎后24 h右后足肿胀达高峰，原发病变持续4 d后逐渐减轻。从致炎后第10天开始，大鼠因迟发型超敏反应而出现对侧左后足和前肢的肿胀、耳和尾部的关节炎小结等继发病变。而冷饭团不同剂量组大鼠的早期炎症和继发病变均有明显减轻，血清 IL－1β、TNF－α水平和关节浸液中PGE2、NO含量亦明显降低。提示冷饭团抗炎作用的机制可能与其抑制细胞因子IL－1β、TNF－α活性和降低炎症递质PGE2、NO含量有关。

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