重组人SHH蛋白N端在HEK293T细胞中的分泌表达与鉴定

龙凤 ，仇玮祎，常旭，林建波，朱恒奇，张景海，王双

1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071；3.枣庄市妇幼保健院，山东 枣庄 277100

Hedgehog（HH）家族蛋白及其信号通路在哺乳动物胚胎发育和组织发生中发挥重要作用，影响着细胞间识别、增殖及细胞命运等众多生理过程。其中，SHH（sonic hedgehog，SHH）对哺乳动物的乳腺、前列腺、肺、毛发和神经系统等多种器官的发育有重要作用[1]。HH 信号通路在慢性炎症的组织修复和癌症发生中也发挥着重要作用[2]，研究发现，多种肿瘤包括基底细胞癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、髓母细胞瘤和神经胶质瘤等的发生和恶化都与SHH 信号通路密切相关[3]。因此，以SHH 及其通路分子作为靶标，研制抗体或小分子抑制剂，通过阻断其与受体的结合，或抑制受体介导的信号通路，对于相关疾病的治疗具有非常重要的意义。在此，我们以SHH 为研究对象，选取其与受体结合的N 端（SHH-N）197和200个氨基酸残基的结构域，分别将其基因克隆入真核瞬时表达载体，在HEK293T 细胞中实现高效分泌表达，利用His 标签进行纯化，获得高纯度的SHH-N 蛋白，为抗SHH 中和抗体及小分子抑制剂的研制提供抗原。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 细胞、pL293 载体质粒由本室保存；大肠杆菌DH5α、Tag酶购自北京全式金生物技术有限公司；人Shh基因全长克隆购自义翘神州生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、BamH 及T4DNA连接酶购自NEB公司；pfu酶购自Promega 公司；dNTP购自宝生物工程公司；SHH单抗购自Sigma公司；HRP 标记的羊抗人二抗购自中杉金桥公司；NiNTA 柱（型号His Trap FF）购自GE 公司；质粒小提试剂盒、DNA 琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；引物合成及测序由军事医学科学院生物工程研究所完成。

1.2 重组人SHH-N表达质粒的构建

采用PCR 方法从所购人ShhcDNA 克隆中获得SHH 蛋白N 端编码序列600 bp 片段，并在PCR 引物中引入His 标签的编码序列。上游引物为5'-CGG AATTCGCCGCCACCATGCTGCTGCTGGCGAGATG-3'，下游引物为5'-CGGGATCCTCAATGGTGATGGT GATGGTGGCCTCCCGATTTGGCCGCC-3'，下划线处分别为引入的EcoRⅠ和BamHⅠ限制酶作用位点。将PCR 产物和pL293真核表达载体同时进行双酶切（37℃2 h），用DNA 凝胶试剂盒回收相应的基因和载体片段，经T4DNA 连接酶连接后得到重组质粒pL293-Shh-N，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌涂布于含100μg/mL 氨苄西林的LB 固体培养基平板上，37℃孵育过夜，挑取单菌落扩大培养，提取质粒，经酶切鉴定正确后进行序列测定。

1.3 重组质粒转染HEK293细胞

将纯化的质粒pL293-Shh-N 转染HEK293T 细胞，同时以载体质粒pL293 转染HEK293T 细胞作为对照。转染前2 d，将7.5×104细胞转接于30 mL 新鲜培养基中，在125 mL 摇瓶中培养，最终细胞浓度为0.25×106/mL，细胞总数为3×107。2 d 后，当细胞密度达到（1.0～1.2）×106/mL 时，将30μg 质粒与脂质体轻柔混合，逐滴加入30 mL细胞中，37℃培养3 d，4℃、2000 r/min离心收集细胞培养上清。

1.4 重组蛋白的纯化

将表达上清用Ni-NTA 柱纯化，纯化步骤参考产品说明书，用500 mmol/L 咪唑洗脱得到所需蛋白，并将其脱盐于pH7.4 的PBS 中，SDS-PAGE 观察条带，并采用Bradford法对纯化的蛋白进行定量。

1.5 纯化产物的ELISA鉴定

将纯化的SHH-N 蛋白样品包被ELISA 板，200 ng/孔，4℃过夜后用PBS 洗涤3 次，用脱脂奶粉于室温封闭2 h 后加入兔抗人SHH 抗体（1∶50），37℃作用1 h，用PBS 彻底洗涤，再与HRP 标记的山羊抗鼠IgG（二抗，1∶2000）于37℃相互作用1 h，用PBS充分洗涤后加入OPD 染色，室温显色5～10 min 后加入50μL 2 mol/L H2SO4终止液终止显色，用分光光度计检测D492nm/D630nm值。

2 结果

2.1 表达质粒pL293-Shh-N的构建

根据文献报道，SHH-N 蛋白（1～200 残基）含有受体结合区域。本研究选择1～197和1～200 氨基酸残基为目的蛋白序列。从含Shh全长基因的质粒中，经PCR 分别获得SHH-N 端编码序列591和600 bp 片段，电泳结果显示其大小与预期相符（图1A）。2 条PCR 片段通过EcoRⅠ和BamHⅠ分别克隆入表达载体质粒pL293，获得重组表达质粒pL293-Shh591-his和pL293-Shh600-his，构建的表达质粒经双酶切鉴定正确（图1B），测序结果表明基因克隆正确无误。

2.2 表达产物的纯化

图1 Shh基因片段PCR产物（A）和重组质粒的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切鉴定（B）琼脂糖电泳图

收集转染3 d 后的细胞培养上清，用镍离子柱进行纯化，用60 mmol/L 咪唑洗涤2 次，500 mmol/L咪唑洗脱。各步骤产物行SDS-PAGE。结果表明，500 mmol/L 咪唑可将SHH-591-His和SHH-600-His 洗脱下来，获得纯度较高的目的蛋白，表观相对分子质量约为20×103。SHH-591-His蛋白的表达水平明显高于SHH-600-His（图2）。

2.3 SHH-591-His的Western印迹

进一步对纯化的SHH-591-His 蛋白进行Western印迹，结果见图3，与空载体质粒转染细胞上清相比，其在相对分子质量约20×103处有2 条特异性表达条带，与预期分子大小相符，其中表观分子质量相对较大的条带应为糖基化的SHH-591-His。

2.4 表达纯化产物的ELISA鉴定

分别用抗His标签抗体和抗SHH-N中和抗体对相同浓度的纯化产物进行ELISA分析，以含有His标签的重组VEGF（血管内皮生长因子）为对照，结果见图4。SHH-591-His、SHH-600-His 及含His 标签的对照蛋白VEGF 均可特异性结合抗His标签抗体，而SHH-591-His 与抗SHH 中和抗体的结合能力却明显高于SHH-600-His，提示其在结构上可能更接近于天然SHH，更适合作为研制功能抗体的抗原蛋白分子。

3 讨论

图2 SHH重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE

SHH 蛋白是一种高度保守的分泌型糖蛋白，属于细胞外配体。SHH 蛋白全长包含462 个氨基酸残基，由N 端（1～197 残基）和C 端（SHH-C，198～462 残基）2个结构域组成，其中SHH-N具有与受体结合并激活其下游信号通路的活性，而SHH-C 则具有自身蛋白水解酶活性和胆固醇转移酶功能，负责前体分子的自我加工[4]。SHH 全长分子又称SHH 前体蛋白，其在内质网中通过C端自催化作用分裂成SHHN和SHH-C 两部分，后者可将其上共价结合胆固醇分子转移到SHH-N 的半胱氨酸残基上，使之发生棕榈酰化，从而使SHH-N 成为具有完全生物学功能的成熟蛋白[5]。研究证实，将Shh基因5'端的600 bp核苷酸序列整合入pIRES2-EGFP 载体后转染胰腺癌细胞，获得了具有生物学功能的成熟SHH-N。因此我们认为，虽然缺少C 端棕榈酰化部分，但真核表达的SHH-N 蛋白仍具有SHH 足够的生物学功能，可以作为中和抗体筛选的诱饵抗原[6]。

目前，国内已发表的SHH-N 蛋白表达方式有原核表达[7]和酵母表达系统表达[8]，其糖基化修饰与真核表达仍有差距；而腺病毒或慢病毒表达系统步骤复杂，表达量低，适用于细胞转染后功能方面的研究，但不适于抗原制备[9-10]。由于SHH-N 具有糖基化修饰，选择真核表达系统将更好地保证其生物学活性，本研究结果也证实其的确具有一定程度的糖基化。由于其1～197 残基为报道的SHH-N 序列，但有研究者表达了1～200 残基，因此，在本研究中，我们也分别表达了1～197和1～200 残基2 种截短体。然而进一步研究发现，SHH-600 的表达量明显低于SHH-591，且SHH-591与SHH 中和抗体的结合活性明显高于SHH-600，提示SHH-591 的结构更适合作为蛋白抗原。本研究为以SHH 为靶点的中和抗体研制奠定了基础。

图3 SHH-591-His蛋白的Western印迹

图4 SHH-591-His和SHH-600-His的ELISA结合活性分析

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