MDM2与端粒保护蛋白1的相互作用及其功能

王亚楠，金蕊，马世良，黄君健

1.沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

端粒保护蛋白（protection of telomeres，POT1）位于端粒末端，保护端粒的稳定性[1-2]。在人类细胞中，POT1、TPP1、RAP、TRF1、TRF2和TIN2 形成一个蛋白六聚体，定位于端粒末端，其中POT1 与端粒末端的单链序列TTAGGG 具有很强的结合力，且这种结合具有序列特异性[3-4]。POT1 与其他端粒蛋白一起保护端粒末端，使其区别于DNA 断端，防止被核酸酶分解，抑制ATR 依赖的DNA 损伤反应的发生，POT1 决定人类染色体末端的结构，保护染色体末端避免非同源重组[5]。实验发现，POT1 对端粒长度的调节具有双重作用，既可能延长端粒也可能缩短端粒，表明POT1在细胞中的表达水平对于细胞的生长代谢是非常重要的[6]。

在EBI 网站（http://www.ebi.ac.uk/）搜索，已通过酵母双杂交方法验证与POT1 有相互作用的蛋白很多，如KRT18、AVTN4、ZNF32、GRB、MDM2、MVP等，其中MDM2 是一个E3 泛素化连接酶，细胞水平上MDM2 与POT1 是否有相互作用及MDM2 对POT1是否具有调节功能仍是未知的。

鼠双微体2 同源体（mouse double minute 2 homolog，MDM2，也被称作E3 泛素化蛋白连接酶MDM2）是一个癌基因的编码产物[7-8]，由491 个氨基酸残基构成，相对分子质量为56×103。它包含一些保守结构区域，包括N 端P53 结合位点、中心的酸性区域（230～300 残基）、锌指区域和C 端的RING 区域（430～480 残基）[9-10]。MDM2 对P53 肿瘤抑制因子起负调控的作用，一方面它抑制P53 的转录激活[11]，同时也作为E3泛素化连接酶，主要通过蛋白酶体途径降解其自身和P53，它识别P53的N 端转录激活区域（TAD）使其降解[12]。研究发现，MDM2基因在人类的许多恶性肿瘤中高表达[13-14]。

探究MDM2与POT1的相互关系，对肿瘤的治疗研究具有一定的指导意义。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa细胞、稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞由本实验室保存；蛋白酶体抑制剂MG132、辣根过氧化物酶标记的二抗购自Sigma 公司；LipofectAMINE 2000、LipofectAMINE RNAiMAX、MDM2 siRNA 均购自Invitrogen 公司；MDM2 抗体购自Santa Cruz Biotechnology 公司；Flag 抗体、Myc 抗体购自MBL 公司；GAPDH 抗体购自天津三箭生物技术有限公司；Western 印迹显色试剂盒购自Thermo 公司；核酸电泳系统、蛋白质电泳系统、半干转膜仪均购自Bio-Rad公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 细胞培养

将HeLa 细胞及稳定表达外源Flag-POT1 的HeLa 细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100μg/mL 链霉素的DMEM 培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养，每隔2～3 d将细胞传代培养。

1.3 siRNA转染

从Invitrogen 公司购买3 条MDM2 siRNA（MDM2si1、MDM2si2、MDM2si3）及1 条对照siRNA（MDM2sicontrol），按照说明书稀释至5μmol/L；将HeLa 细胞用胰酶消化，用无血清的DMEM 吹打混匀，细胞计数，取约105细胞加入6 孔板的一个孔；分别取siRNA 各3μL 加入500μL 无抗生素无血清的DMEM 中，再分别加入3μL RNAiMAX，混匀，静置20 min，分别加入6 孔板中，混匀，37℃培养箱中培养48 h后收集细胞，Western印迹检测其抑制效果。

1.4 质粒转染

将HeLa 细胞铺6 孔板，当细胞铺板面的70%～80%时瞬转质粒Myc-MDM2 及Flag-POT1，转染程序按照LipofectAMINE 2000 说明书进行，培养48 h后收集细胞。

1.5 Western印迹检测siRNA的抑制效果

收集细胞后，用RAPI 裂解液裂解细胞，提取蛋白质进行SDS-PAGE，然后将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭1 h，一抗孵育2 h，用TBST清洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，用TBST 清洗3 次，每次5 min，按照Western 印迹显色试剂盒说明书显色1～2 min，暗室压片显影。

1.6 免疫共沉淀验证MDM2与POT1的相互作用

收集细胞后，加入中盐IP 缓冲液，冰上裂解30 min，12 000 r/min、4℃离心10 min，将上清转移至新的Ep 管中，取出20%冻存，其余上清备用；取琼脂糖珠Flag-beads（每个样品20μL），用中盐IP 缓冲液平衡，加入IP缓冲液500μL，3000 r/min、4℃离心1 min，弃上清，重复上述操作3 次；将Flag-beads 用IP缓冲液重悬，均分到待用上清液中，用裂解液补足500μL，4℃旋转过夜；用裂解液洗3 次，每次10 min，旋转清洗，3000 r/min、4℃离心2 min，留少量上清，加入5×上样缓冲液煮10 min，电泳上样，后续步骤同Western印迹。

2 结果

2.1 用MG132 处理稳定表达Flag-POT1 的HeLa 细胞

2 皿Flag-POT1 细胞，其中一皿不做处理，另一皿加10μmol/L MG132 处理6 h 后收集细胞，Western 印迹检测，结果（图1）表明Flag-POT1 的表达水平出现明显升高并且有拖尾现象，说明POT1是通过蛋白酶体-泛素化途径降解的。

2.2 MDM2 siRNA对MDM2蛋白的抑制效果

在HeLa 细胞中分别转染MDM2sicontrol、MDM2si1、MDM2si2和MDM2si3，48 h后收集细胞进行Western印迹，实验结果经PS5软件分析，发现3条siRNA 对MDM2 都有不同程度的抑制作用，抑制率分别为35%、40%和88%，MDM2si3 的抑制效果最好（图2）。表明MDM2si3 对MDM2 具有较好的沉默效果，后续实验将用MDM2si3来抑制MDM2的表达。

图1 MG132处理HeLa细胞后Flag-POT1的表达情况

2.3 Flag-POT1与Myc-MDM2的相互作用

3 皿HeLa 细胞，一皿转入Myc-MDM2 质粒，一皿转入Flag-POT1 质粒，一皿用Myc-MDM2 质粒和Flag-beads 质粒共转，48 h 后收集细胞进行免疫共沉淀实验，结果表明POT1与MDM2有较强的相互作用（图3）。

2.4 MDM2对Flag-POT1表达水平的影响

3 皿Flag-POT1 细胞，一皿不做处理，一皿转入Myc-MDM2 质粒，一皿转入MDM2si3，48 h 后收集细胞行Western 印迹，结果表明MDM2 对POT1 的表达水平没有明显的影响（图4）。说明MDM2 虽然与POT1 在细胞水平存在相互作用，但MDM2 不是POT1 的E3 泛素化连接酶，或者说不是主要的E3 泛素化连接酶。

3 讨论

图2 MDM2 siRNA对MDM2蛋白的抑制效果

图3 Flag-POT1与Myc-MDM2的相互作用

图4 MDM2对Flag-POT1表达水平的影响

POT1 是端粒复合体shelterin 的主要成员，主要与端粒3'端结合，保护端粒的完整性，在许多肿瘤细胞中表达发生异常或基因序列发生突变。与意义未定的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）病人相比，多发性骨髓瘤（MM）病人中POT1 的基因表达明显升高，它可能参与MGUS 到MM 的转变过程[15]。胃癌晚期较胃癌早期POT1的表达水平显著升高，其成为恶性程度的标志[16]。在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中，Tyr36、Lys90、Gln94 发生突变，使POT1 不能与端粒3'单链结合，导致端粒功能异常[17]。这些表明POT1在肿瘤的发生及发展中起重要作用，成为疾病前期诊断的依据，为设计新的治疗策略的可能分子靶标提供了证据。

研究发现，肿瘤中肿瘤抑制因子P53 发生了突变或表达降低，但仍有约50%的肿瘤表达野生型的P53，而MDM2 通过泛素化途径调节它的活性，使其发生降解，导致肿瘤的形成。抑制MDM2的表达，可以降低前列腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，说明MDM2 在前列腺癌生长方面有重要作用[18-19]。抑制MDM2 与P53 的相互作用，成为治疗肿瘤的新的策略。

在本实验中我们发现，POT1 经过蛋白酶体-泛素化途径降解，与E3 泛素化连接酶MDM2 在细胞水平具有相互作用，但无论是高表达MDM2 还是敲除MDM2，POT1 的表达量都没有明显的变化，表明MDM2 不是POT1 的E3 泛素化连接酶或者不是POT1 的主要E3 泛素化连接酶。POT1 与MDM2 在肿瘤的发生发展及诊断治疗中都具有重要的作用，MDM2 与POT1 有明显的相互作用，为研究POT1 与MDM2 其他的功能及肿瘤治疗新的策略提供了重要依据。

[1]Baumann P,Cech T R.POT1 the putative telomere endbinding protein in fission yeast and humans[J].Science,2001,292(5519):1171-1175.

[2]Palm W,de Lange T.How shelterin protects mammalian telomeres[J].Annu Rev Genet,2008,42:301-334.

[3]Lei M,Podell E R,Baumann P,et al.DNA self-recognition in the structure of Pot1 bound to telomeric single-stranded DNA[J].Nature,2003,426:198-203.

[4]Lei Ming,Podell E R.Structure of human POT1 bound to telomeric single-stranded DNA provides a model for chromosome end-protection[J].Nat Struct Mol Biol,2004,11:1223-1229.

[5]Hockemeyer D,Sfeir A J,Shay J W,et al.POT1 protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end[J].EMBO J,2005,24:2667-2678.

[6]Bunch J T,Bae N S,Leonardi J,et al.Distinct requirements for Pot1 in limiting telomere length and maintaining chromosome stability[J].Mol Cell Biol,2005，,25(13):5567-5578.

[7]Oliner J D,Kinzler K W,Meltzer P S,et al.Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas[J].Nature,1992,358(6381):80-83.

[8]Wade M,Wong E T,Tang M,et al.Hdmx modulates the outcome of p53 activation in human tumor cells[J].J Biol Chem,2006,281(44):33036-33044.

[9]Kussie P H,Goruna S,Marechal V.Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain[J].Science,1996，274(5289):948-953.

[10]Poyurovsky M V.The Mdm2 RING domain C-terminus is required for supramolecular assembly and ubiquitin ligase activity[J].EMBO J,2007,26:90-101.

[11]Momand J,Zambetti G P,Olson D C,et al.The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation[J].Cell,1992,69(7):1237-1245.

[12]Michael D,Oren M.The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system[J].Cancer Biol,2003,13(1):49-58.

[13]Momand J,Jung D,Wilczynski S,et al.The MDM2 gene amplification database[J].Nucl Acids Res,1998,26(15):3453-3459.

[14]Freedman D,Levine A J.Functions of the MDM2 oncoprotein[J],Cell Mol Life Sci,1999,55(1):96-107.

[15]Panero J,Stanganelli C,Arbelbide J,et al.Expression profile of shelterin components in plasma cell disorders clinical signifi cance of POT1 overexpression[J].Blood Cell Mol Dis,2014,52(2-3):134-139.

[16]Kondo T,Oue N,Yoshida K,et al.Expression of POT1 is associated with tumor stage and telomere length in gastric carcinoma[J].Cancer Res,2004,64:523-529.

[17]Ramsay A J,Quesada V,Foronda M,et al.POT1 mutations cause telomere dysfunction in chronic lymphocytic leukemia[J].Nat Genet,2013,45(5):526-532.

[18]Vassilev L T.MDM2 inhibitors for cancer therapy[J].Trends Mol Med,2006,13(1):23-31.

[19]Zhang Zhuo,Li Mao,Wang Hui.Antisense therapy targeting MDM2 oncogene in prostate cancer:effects on proliferation,apoptosis,multiple gene expression and chemotherapy[J].Proc Acad Natl Sci USA,2003,100(20):11636-11641.