皮肤分枝杆菌DNA提取方法比较分析

闫桢桢 姜海琴 崔盘根 王洪生 孙建方

皮肤分枝杆菌DNA提取方法比较分析

闫桢桢 姜海琴 崔盘根 王洪生 孙建方

目的比较分枝杆菌DNA提取的常用方法。方法分别采用传统的冻融法和两种试剂盒(A、B)对不同浓度结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和耻垢分枝杆菌纯菌悬液及模拟标本进行总DNA提取。通过检测DNA纯度和PCR产物比较3种方法的提取效果,并应用临床皮肤组织标本进一步验证。结果3种方法提取的分枝杆菌DNA均能用于PCR检测。试剂盒A获得的DNA纯度最高,冻融法其次,试剂盒B杂质最多;灵敏性检测显示3种方法可检测出的纯菌悬液最低浓度皆为102菌细胞/ml;对于模拟标本,在103菌细胞/ml时检出率为100%,在102菌细胞/ml时试剂盒A、B和冻融法检出率分别为60%(12/20)、55%(11/20)、55%(11/20);临床标本检测结果提示,试剂盒B可用于石蜡标本DNA的提取,对分枝杆菌感染组织提取率同其它两种方法基本一致。结论试剂盒A通过多次过柱洗涤可快速获得分枝杆菌的优质基因组DNA,为实验研究及临床检测的首选;试剂盒B单次试剂处理除适用于石蜡标本提取DNA外,可用于新鲜组织标本的协同检测。

分枝杆菌属;组织提取物;DNA提取方法

作者单位:210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所

皮肤分枝杆菌感染的致病菌种的快速检测与鉴定对于及时有效地指导临床用药、提高疗效和改善预后具有重要意义。目前,除传统的镜检、培养及生化鉴定方法外,已有多种分子生物学相关技术在实验室和临床应用中进行探索实践[1-5]。随着基因检测技术的不断完善及规范,以核酸检测为基础的分子诊断的重要性日益显现。其中,皮肤组织中致病菌核酸的高效提取是分子诊断成功与否的先决条件。因此,我们对实验室中常用的冻融法及两种微生物核酸提取试剂盒进行分枝杆菌核酸提取效率的分析比较。

一、资料与方法

1.菌株来源及培养:标准菌株结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)来自我所保存株。2012年9月至2013年11月地我所门诊收集疑似临床皮肤分枝杆菌感染标本76例。各标准株传代,接种于改良罗氏培养基后,根据其最适生长温度分别放于32℃、37℃培养。

2.主要试剂和仪器:GoTaq Green Master Mix,产自美国Promega公司;BIOWEST®琼脂糖产自西班牙Biowest公司;DNA Marker B(100 bp Ladder,加拿大BBI公司);两种DNA抽提试剂盒 QIAamp® DNA Mini试剂盒(A)、TaKaRa DEXPAT®试剂盒(B)分别产自德国Qiagen公司和大连宝生物工程有限公司;PCR扩增仪产自杭州LongGene公司;凝胶成像系统产自美国Bio-Rad公司。

3.实验方法:

(1)引物设计:根据分枝杆菌16S rRNA DNA的保守序列区设计引物,上游引物:5'-GAGATACTCGAGTGGCGAAC-3',下游引物:5'-GGCCGGCTACCCGTGGTC-3'。扩增片段为208 bp。

(2)分枝杆菌纯菌悬液的制备:方法见文献[6],将纯菌悬液依次稀释至10～105菌细胞/ml。

(3)模拟标本的制备:模拟组织标本制备方法见文献[7],分别按设计加入分枝杆菌菌悬液,使各管中细菌终浓度分别为10～104菌细胞/ml,制成模拟皮肤分枝杆菌感染组织标本。

4.纯菌悬液和模拟标本DNA的提取:①冻融法释放细菌DNA:每份标本取200 μl进行冻融,即液氮冷冻1min,沸水煮沸1min,反复5次,其中最后一次煮沸10min。-20℃保存备用;②试剂盒A、B:严格按各自说明书操作,其中每份标本取200 μl进行DNA提取,-20℃保存备用。

5.临床标本的培养及DNA的提取:临床标本组织均浆的制备见文献[2];每份取200 μl分别采用冻融法及两种试剂盒进行DNA提取,-20℃保存备用。

6.DNA纯度和浓度检测:将不同方法获得的基因组DNA样本各2 μl稀释50倍,用分光光度计在波长260 nm和280 nm下进行检测,根据DNA的A260/A280值范围判断其纯度。分别用3种方法测定分枝杆菌纯菌悬液在105个菌细胞/ml时的吸光度值,重复20次。

7.PCR反应体系及循环条件:反应总体积为50 μl,含25 μl GoTaq Green Master Mix(含2×反应缓冲液400 μmol/L dATP,400 μmol/L dAGP,400 μmol/L dCTP,400 μmol/L dTTP和 3 mmol/L MgCl2),上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μl,DNA模板2 μl,加无菌去离子水至50 μl。94℃5min预变性后,94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,共进行35个循环,最后72℃延伸5min。扩增产物采用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳,每个加样孔点样6 μl,电泳缓冲液为1×TAE,恒压180 V,电泳20min。电泳结束后,在凝胶成像仪上紫外线透射下观察结果并摄片;模拟皮肤分枝杆菌感染标本重复20次,疑似皮肤分枝杆菌感染标本重复3次。

8.统计学处理:采用SPSS10.0软件进行数据分析。3种方法提取DNA质量比较采用方差分析,阳性率比较采用χ2检验,方法一致性采用Kappa检验。检验水准为0.05。

二、结果

1.分枝杆菌DNA提取效果的检测:用紫外分光光度计检测经冻融法和试剂盒A、B提取的基因组DNA,3组DNA的A260/A280值分别为 1.60± 0.03、1.81± 0.06、0.53± 0.07(F=4434.89,P＜0.01),浓度分别为(62±4.82)mg/L,(24±0.67)mg/L,(225±15.06)mg/L;提示试剂盒A提取的分枝杆菌基因组DNA纯度最好,冻融法稍低,试剂盒B含杂质最多。

2.分枝杆菌纯菌悬液及模拟标本PCR检测结果:不同浓度纯菌悬液的PCR产物电泳检测结果(图1,2)显示,3种方法提取的分枝杆菌DNA均可进行PCR反应,产物经测序验证为结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和耻垢分枝杆菌;对纯菌悬液的DNA提取后,可检测的最低细菌浓度均为102菌细胞/ml浓度;而对于模拟标本,可检测的最低细菌浓度为103菌细胞/ml浓度,当浓度在102菌细胞/ml时试剂盒A、B和冻融法检出率分别为60%(12/20)、55%(11/20)、55%(11/20),差异无统计学意义(χ2=0.136,P＞0.05)。相同浓度下培养检出率为75%。

3.疑似皮肤分枝杆菌感染的临床标本PCR检测及培养结果:76份疑似皮肤分枝杆菌感染的临床标本经培养后,12份标本阳性(结核分枝杆菌4例,海鱼分枝杆菌5例,偶遇分枝杆菌1例,脓肿分枝杆菌1例,嗜血分枝杆菌1例);冻融法、试剂盒A和试剂盒B直接提取组织标本中的DNA后PCR检测分别有8、9、9份标本阳性,其中冻融法提取阳性的8份经试剂盒A、B提取均为阳性;1例嗜血分枝杆菌和1例结核分枝杆菌仅分别通过试剂盒A、B提取成功,嗜血分枝杆菌患者的首次培养结果为阴性,因菌种的分子鉴定提示为该菌,予以含红细胞的特殊培养基进行2次培养后获得阳性结果。3种方法同培养法的符合率分别为94.74%、96.05%、96.05%,差异无统计学意义(χ2=0.087,P＞0.05)。3种方法间的吻合度kappa值分别为0.934、0.934和0.874,具有较高的吻合度(均P＜0.01)

图1 耻垢分枝杆菌纯菌悬液不同方法DNA提取后PCR检测M:标准参照物;1:阴性对照;2～4:冻融法提取,纯菌悬液浓度依次为103、102、10菌细胞/ml;5～7:试剂盒A提取,纯菌悬液浓度同前;8～10:试剂盒B提取,纯菌悬液浓度同前

图2 耻垢分枝杆菌模拟临床标本不同方法DNA提取后PCR检测 M:标准参照物;1～4:冻融法提取,模拟临床标本浓度依次为 104、103、102、10菌细胞/ml;5 ～ 8:试剂盒 A 提取,模拟临床标本浓度同前;9～12:试剂盒B提取,模拟临床标本浓度同前

三、讨论

常用的冻融法是在低渗环境下造成细胞裂解,通过高温煮沸使细胞蛋白质变性,暴露出DNA从而进行提取。所提取DNA完整性受到一定破坏,且欠缺杂质去除过程,一定程度上会抑制PCR反应;试剂盒A为多次实验验证的DNA标准纯化提取方法[4],其中所含优化的缓冲液能有效裂解样本,稳定核酸,促进DNA选择性结合到硅胶膜。通过反复洗涤过柱可去除PCR抑制剂(二价阳离子、蛋白等),但同时增加了DNA损耗量。该方法获取DNA产物纯化度最佳,基本可满足多数常用的下游实验研究。试剂盒B步骤简易,仅需加入一种独特的表面活性剂与吸附PCR反应抑制物树脂的混合制剂。其操作过程DNA丢失较少,但所用为回收制剂而非纯化制剂故纯化度较差。

本研究选择分枝杆菌3类菌的标准菌株(结核、麻风和非结核分枝杆菌),同步验证实验室常用的3种分枝杆菌DNA提取方法并将结果进行比较分析。我们发现冻融法省时低耗,检测纯菌悬液灵敏度同试剂盒法基本一致,但获得的DNA纯度不及试剂盒A。将两种试剂盒方法相互比较:在操作方面,试剂盒B较试剂盒A简便省时,但前者煮沸过程若EP管锡箔纸封口不严或过于严密内压快速增加则容易导致管口泄露样本被污染;灵敏性方面,在提取纯菌菌液及模拟标本时两者基本一致。对于临床样本,未观察出两者检出率存在明显的统计学差异,部分结果的不一致可能同所检测组织中所含菌量不同有关。由于标本量相对较少,需进一步验证。

[1]张彩萍,丁克云,王洪生,等.PCR-RELP法直接检测分枝杆菌皮肤感染的临床应用[J].中国麻风皮肤病杂志,2013,29(3):158-161.

[2]蔡林,赵亭,张建中.PCR-RELP分析鉴定皮肤组织中的分枝杆菌[J].中华皮肤科杂志,2007,40(6):353-355.

[3]Aldous WK,Pounder JI,Cloud JL,et al.Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR[J].J Clin Microbiol,2005,43(5):2471-2473.

[4]Leung ET,Zheng L,Wong RY,et al.Rapid and simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and Beijing/W genotype in sputum by an optimized DNA extraction protocol and a novel multiplex real-time PCR[J].J Clin Microbiol,2011,49(7):2509-2515.

[5]Käser M,Ruf MT,Hauser J,et al.Optimized DNA preparation from mycobacteria[J/OL].Cold Spring Harb Protoc,2010,2010(4):pdb.prot5408[2013-12-10].http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5408.short.

[6]李晓杰,吴勤学,刘训荃.鸟分支杆菌聚合酶链反应检测的研究[J].中华皮肤科杂志,2003,36(12):679-681.

[7]王洪生,李晓杰,吴勤学,等.PCR直接检测皮肤分枝杆菌感染的研究[J].中华皮肤科杂志,2006,39(10):593-595.

2014-01-13)

(本文编辑:尚淑贤)

Comparison of three methods for the extraction of mycobacterial DNA

Yan Zhenzhen,Jiang Haiqin,Cui Pangen,Wang Hongsheng,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Wang Hongsheng,Email:whs33@vip.sina.com;Sun Jianfang,Email:sunjf@163.com

ObjectiveTo compare three methods for the extraction of mycobacterial DNA.MethodsTwo commercial DNA extraction kits and an ordinary freeze-thawing method were used to extract DNA from the pure suspensions of three species ofMycobacteria(M.tuberculosis,M.lepraeandM.smegmatis)at different densities(1×10 to 1×105cells/ml),simulated clinical specimens containing different concentrations of mycobacterial cells(1×10 to 1×104cells/ml).The purity and concentration of the extracted DNA were evaluated.Then,PCR was performed to amplify the 16S rRNA region ofMycobacteria.The performance of the three methods was compared by the purity and concentration of extracted DNA as well as the results of PCR.Further more,76 clinical skin specimens suspected to be infected withMycobacteriawere used to further validate the performance of these methods.ResultsAll the extracted DNA samples could be detected by PCR.The highest purity of DNA was obtained by the kit A,followed sequentially by the freeze-thawing method and the kit B.When pure suspensions were used,the detection limit was consistently 1×102cells/ml for all the three methods.With simulated specimens,the detection rate was consistently 100%for all the three methods at the concentration of 1×103cells/ml,60%(12/20),55%(11/20)and 55%(11/20)for the kit A,kit B and freeze-thawing method respectively at the concentration of 1×102cells/ml.The analysis of clinical specimens showed that the kit B could be used to extract DNA from paraffin-embedded specimens,with the detection rate similar to that of kit A and freeze-thawing method.ConclusionsThe kit A could rapidly yield high-quality genomic DNA ofMycobacteriaby repeated cleaning of columns,and may serve as the optimal method for scientific and clinical studies,and the kit B is suitable for extracting mycobacterial DNA from fresh tissue specimens besides paraffin-embedded specimens.

Mycobacterium;Tissue extracts;DNA extraction methods

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.016

卫生部部属(管)医院临床学科重点项目(2010-2012-125)

王洪生,Email:whs33@vip.sina.com;孙建方,Email:sunjf@163.com