木脂素促进人胃癌MGC-803细胞凋亡

李红国，刘双萍，崔银姬，李柱虎

(延边大学 医学院 病理学教研部， 吉林 延吉 133002)

A.control group；B.experiment group in 48 hours(25 μmol/L)；C.experiment group in 72 hours(25 μmol/L)

木脂素促进人胃癌MGC-803细胞凋亡

李红国，刘双萍，崔银姬，李柱虎*

(延边大学 医学院 病理学教研部， 吉林 延吉 133002)

木脂素(lignans)是一类由苯丙素氧化聚合而成的天然产物，多以二聚体的形式存在，少数为三聚体和四聚体。木脂素类化合物具有广泛的生物活性[1]，如抗肿瘤、抗氧化、降压、镇静和保肝等。

目前，木脂素对胃癌细胞抗增殖及机制方面的研究尚未见报道。因此，本实验通过木脂素对胃癌细胞增殖的影响与Bax和Bcl-2等蛋白之间的相关性的研究，初步探讨木脂素对胃癌细胞的抗增殖作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人胃癌MGC-803细胞系。

1.1.2 主要试剂：木脂素由延边大学药学院生药学教研部提供(纯度为99.9%，化学名称为内消旋二氢愈创木脂酸，meso-dihydroguaiaretic acid)；Bax和Bcl-6单克隆抗体(Santa Cruz公司)；Bcl-2单克隆抗体(碧云天生物技术研究所)；ABC免疫组化检测试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞生存率的检测：取对数生长期细胞用于下列实验，细胞数为3×104个/孔，采用MTT方法。细胞生存率(%) = 实验组吸光值/对照组吸光值 ×100%。实验重复进行3次。

1.2.2 检测Bax、Bcl-2和Bcl-6蛋白的表达：用ABC免疫组化检测试剂盒。实验重复进行3次。Bax、Bcl-2和Bcl-6抗体的稀释比例均为1∶50。免疫细胞化学染色结果判定根据Bax以胞质呈棕褐色为阳性；Bcl-2和Bcl-6以胞核呈棕黄色为阳性。阳性表达率(%)=阳性细胞总数/总细胞数×100%。

1.2.3 细胞凋亡及细胞周期的检测：采用流式细胞技术，实验重复3次。

1.2.4 透射电镜观察：胃癌细胞的形态学变化。

2 结果

2.1 细胞生存率的检测结果:不同浓度的木脂素处理的MGC-803胃癌细胞的生存率呈浓度和时间依赖性降低(Plt;0.05)。其IC50值为24.8 μmol/L(表1)。

表1 不同浓度木脂素在不同时间段对MGC-803胃癌细胞存活率的影响

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control group.

2.2 免疫细胞化学的检测结果

2.2.1 Bax、Bcl-2和Bcl-6蛋白的检测结果(表2，图1)。

2.2.2 细胞凋亡及细胞周期检测结果：48和72 h对照组凋亡率分别为2.3%±0.4%和2.3%±0.4%，25 μmol/L浓度木脂素处理的实验组凋亡率分别为15.5%±1.6%和19.8%±2.5%(Plt;0.01)。对照组G1期、G2期和S期细胞百分

A1.expression of Bax protein was weakly positive in control group；A2.expression of Bax protein was strong positive in experiment group；B1.expression of bcl-2 protein was strong positive in control group；B2.expression of Bcl-2 protein was weakly positive in experiment group；C1.expression of Bcl-6 protein was Strong positive in control group；C2.Expression of Bcl-6 protein was negative in experiment group

图1 免疫细胞化学方法检测MGC-803细胞Bax、Bcl-2和Bcl-6蛋白表达的影响

*Plt;0.01 compared with control group.

A.control group；B.experiment group in 48 hours(25 μmol/L)；C.experiment group in 72 hours(25 μmol/L)

图2流式细胞技术检测细胞凋亡及细胞周期的影响
Fig2Detectedtheeffectofapoptosisandcellcyclebyflowcytometry(FCM)

比为54.4%、13.6% 和32.0%；实验组48 h时为62.1%、8.0%和30.0%；72 h时为60.7%、12.5%和26.3%(图2)。

2.2.3 透射电镜观察结果：实验组MGC-803胃癌细胞形成凋亡小体，呈现出凋亡细胞典型的形态学改变(图3)。

A.control group gastric carcinoma cell(×6 000)；B.experiment group gastric carcinoma cell (×8 000)图3 透射电镜观察胃癌细胞的形态学变化Fig 3 Observation on morphological changes of gastric cacinoma cells using a transmission electron microscope

3 讨论

木脂素在自然界分布广泛，研究表明木脂素具有明显的抗肿瘤作用[2]。木脂素对多种人肿瘤细胞具有促进细胞凋亡的作用。

本研究结果表明，木脂素对MGC-803胃癌细胞具有明显的抗增殖作用，并具有浓度和时间依赖性。细胞凋亡率和细胞周期检测结果，实验组凋亡率与对照组相比有显著性差异，说明，木脂素可促进胃癌细胞凋亡。同时，木脂素可下调Bcl-2和Bcl-6蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，表明木脂素通过Bcl-2/Bax蛋白及Bcl-6蛋白的调控来促进细胞凋亡。细胞周期检测结果，实验组G1期细胞百分比增多，而S期及G2期细胞百分比减少，说明，木脂素可阻止细胞从细胞周期G1期进入S期，从而抑制肿瘤细胞DNA合成，抑制肿瘤细胞的增殖。

[1] Chiu HF, Chen TY, Tzeng YT,etal. Improvement of liver function in humans using a mixture of schisandra fruit extract and sesamin[J]. Phytother Res, 2013,27:368-373.

[2] Jeong JB, Hong SC, Jeong HJ,etal. Arctigenin induces cell cycle arrest by blocking the phosphorylation of Rb via the modulation of cell cycle regulatory proteins in human gastric cancer cells[J]. Int Immunopharmacol, 2011,11:1573-1577.

2013-07-21

2013-10-25

吉林省教育厅项目[吉教科合字(2009)第4号]

*通信作者(correspondingauthor)： lizh@ybu.edu.cn

1001-6325(2014)05-0704-03

R 361+.1

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