肿瘤pH微环境通过激活β-catenin/TCF4增强人乳腺癌肿瘤细胞的干性

曹峰琦，陈 翀，刘 妍，白丽鹏，罗云萍

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 免疫学系，北京 100005)

研究论文

肿瘤pH微环境通过激活β-catenin/TCF4增强人乳腺癌肿瘤细胞的干性

曹峰琦，陈 翀，刘 妍，白丽鹏，罗云萍*

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 免疫学系，北京 100005)

目的探讨酸性微环境对于乳腺癌肿瘤干细胞干性的影响及其作用机制。方法分别在pH 6.8和7.4的环境下，培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231。用流式细胞术、PCR、Western blot、体外成球实验和细胞划痕实验分别检测肿瘤干细胞ALDHhigh细胞亚群的比率，干性基因SOX2、OCT4和Lin28b的表达，成球能力和肿瘤细胞迁移能力，同时检测相关信号通路的激活。结果酸性微环境通过激活β-catenin/TCF4信号通路提高MDA-MB-231的ALDHhigh细胞亚群的比例(Plt;0.05)，上调干性相关基因的表达(Plt;0.01)，增强体外成球能力(Plt;0.01)和迁移能力(Plt;0.05)。结论酸性微环境能够上调干细胞比例，维持肿瘤干细胞干性特征，增加乳腺癌肿瘤细胞迁移能力。

乳腺癌；肿瘤干细胞；酸性微环境

肿瘤干细胞是一群具有高抗放化疗特性，能自我更新，自我修复，具有多向分化潜能，能够在体外形成克隆的一群比例极小的细胞亚群，目前认为是造成肿瘤复发转移的根源之一[1-3]。近几年在多种恶性肿瘤组织中都成功的分离出了肿瘤干细胞，为肿瘤干细胞学说提供了充分的证据支持[4-6]。虽然肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占的比例极少，但他们独特的干细胞表型是肿瘤逃逸常规的放化疗，导致复发转移的主要原因[7-8]。

肿瘤干细胞干性的维持需要其所处的微环境的支持。大量的研究证实，恶性肿瘤组织周围的pH值在6.8～6.0之间，甚至更低达5.8。而正常组织周围的pH值一般稳定保持在7.35～7.45之间[9-11]。长期以来人们认为酸性微环境是低氧造成的，而忽略了肿瘤细胞独特的代谢型--瓦伯格效应，即肿瘤细胞无论是有氧还是低氧环境下都进行糖酵解反应，从而产生大量的乳酸和氢离子外排，进而形成了酸性微环境。

已有的研究主要都放在了低氧微环境对于肿瘤干细胞干性的维持方面，鲜有文献报道酸性微环境对于肿瘤干细胞干性的影响，本研究主要探讨酸性微环境对于乳腺癌肿瘤干细胞的作用，并进一步探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。细胞培养基DMEM、胎牛血清、细胞培养用双抗、100×青霉素-链霉素溶液、100×非必需氨基酸(NEAA)和HEPES缓冲液(GIBCO公司)； MES缓冲液(Sigma公司)。ALDH检测试剂盒(StemCell公司)。兔抗人OCT4，SOX2，Nanog，Lin28b，β-catenin及TCF4抗体(Cell Signaling Technology公司)。鼠抗人HIF1α抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 细胞培养与处理

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231常规培养在含10%胎牛血清、1%双抗(青链霉素溶液)和1%非必需氨基酸(NEAA)的DMEM培养液中，培养条件为37 ℃、5% CO2，细胞汇合至80%～90%后用胰蛋白酶消化传代。分别利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液调节细胞培养液pH为7.4或6.8。分别在pH为7.4和6.8的完全培养液中培养细胞。

1.3 方法

1.3.1 流式细胞术检测ALDHhigh细胞群比例： 将2 mL MDA-MB-231人乳腺癌细胞以5×105个/mL接种于6孔板中，分为两组，每组3孔，分别为pH值为7.4的对照组和pH值为6.8的实验组。培养12和24 h后，消化收集细胞，300×g离心5 min，PBS漂洗3次，吹打成单细胞悬液，并进行计数，调整细胞浓度为5×105个/mL，重悬于ALDH 测定缓冲液，并按照ALDH检测试剂盒说明书检测ALDHhigh细胞群比例。

1.3.2 PCR检测相关基因表达： 将2 mL MDA-MB-231人乳腺癌细胞以5×105个/mL接种于6孔板中，分为两组，每组3孔，分别为pH值为7.4的对照组和pH值为6.8的实验组。培养12 h后，按常规Trizol法提取细胞总RNA,进行反转录，合成cDNA。应用特定基因引物进行RT-PCR和real-time PCR反应。

1.3.3 Western blot检测相关基因表达： MDA-MB-231人乳腺癌细胞分别在pH值7.4和pH值6.8的环境下培养12 h，PBS漂洗3次，提取细胞总蛋白。传统Western blot方法进行电泳，转膜，封闭，敷抗体，显影。

1.3.4 体外成球实验： 新鲜配制成球培养基即DMEM/F12无血清培养基内添加2%的B27、20 ng/mL的表皮生长因子(EGF)、20 ng/mL的成纤维细胞生长因子(FGF)和1%的双抗。分别利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液调节细胞培养液pH为7.4或6.8。以5 000个/孔接种MDA-MB-231人乳腺癌细胞于6孔板，5 d后统计成球量，计算其成球能力。

1.3.5 细胞划痕实验： 6孔板接种MDA-MB-231人乳腺癌细胞，待细胞完全布满孔底部，进行划痕实验。用黄枪头在每个孔中平直划一道线，然后将孔中培养基换成经4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液调节pH为7.4或6.8的含1%胎牛血清的培养基；每道划痕选取3个独立视野拍照，分别记录0 和24 h后镜下划痕的宽度，然后根据平均值计算每道划痕的宽度。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1酸性微环境增加人乳腺癌细胞系MDA-MB-231肿瘤干细胞ALDHhigh细胞群比例

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231在pH为6.8的微环境下培养12 h，其肿瘤干细胞ALDHhigh细胞亚群比率(21.7%±0.07%)相比于在pH为7.4的微环境下培养者(5.88%±0.23%)，有显著的增高(Plt;0.01)(图1A)。分别在pH为6.8的微环境下(12.40%±0.85%)和pH为7.4的微环境下(5.07%±0.56%)培养24 h，酸性微环境下其肿瘤干细胞ALDHhigh细胞亚群比率也同样有明显的增高(Plt;0.05)(图1B)。

A.treated by 12 hours; B.treated by 24 hours; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with pH 7.4 control group图1 MDA-MB-231细胞在不同pH微环境下培养肿瘤干细胞ALDHhigh细胞群比例

2.2酸性微环境上调人乳腺癌细胞系MDA-MB-231干性基因的表达

与在pH为7.4的微环境下培养相比，酸性微环境可以显著上调MDA-MB-231细胞OCT4、SOX2和Lin28b等干性基因RNA水平(图2A，B)和蛋白质水平(图2C)的表达。

2.3酸性微环境提高人乳腺癌细胞系MDA-MB-231体外成球能力

在pH为7.4的微环境下， MDA-MB-231细胞体外成球能力为8.57%±0.12%。而在pH为6.8的微环境下，MDA-MB-231细胞体外成球能力显著提高至12.47%±0.18%(Plt;0.01)(图3)。

2.4酸性微环境增强人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的迁移能力

在pH为7.4的微环境下， MDA-MB-231细胞的24 h迁移率为0.07%±0.02%。而在pH为6.8的微环境下，MDA-MB-231细胞的24 h迁移率显著增强，达到0.17%±0.03%(Plt;0.05)(图4)。

A.RT-PCR; B.real-time PCR; C.Western blot; *Plt;0.01, **Plt;0.001 compared with pH 7.4 control group图2 不同pH微环境下MDA-MB-231细胞干性基因的表达结果Fig 2 The expression of stemness genes in MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium

A.sphere test(×100); B.quantitative results; *Plt;0.01 compared with pH 7.4 control group图3 不同pH微环境下MDA-MB-231细胞体外成球功能Fig 3 Sphere formation of MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium(×100)

2.5酸性微环境可以激活β-catenin/TCF4信号通路

与正常微环境相比，酸性微环境下β-catenin/TCF4信号通路的活化程度更高，而且转录因子HIF1α的表达也有明显上调(图5)。

3 讨论

肿瘤干细胞理论对于肿瘤的复发和转移提供了坚实的理论基础，大量的研究已经明确了炎性微环境[12-13]，低氧微环境等对于肿瘤干细胞的作用，而酸性微环境与肿瘤干细胞的关系却鲜有报道，本研究通过调节培养液pH来模拟微环境的酸性程度，以pH 6.8模拟肿瘤酸性微环境，pH 7.4模拟正常微环境[14]。分别在酸性微环境和正常微环境下培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，探究酸性微环境对肿瘤干细胞的作用。

A.mobility test(×40); B.quantitative results; *Plt;0.05 compared with pH 7.4 control group图4 不同pH微环境下MDA-MB-231细胞迁移能力Fig 4 The mobility of MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium(×40)

A.Western blot; B.RNA level of TCF4; *Plt;0.05 compared with pH 7.4 control group图5 酸性微环境激活β-catenin/TCF4信号通路Fig 5 The activation of β-catenin/TCF4 signaling pathway by the acidic microenvironment

肿瘤干细胞研究的难点在于肿瘤干细胞所占的比例微乎其微，而且对于肿瘤干细胞的鉴定也没有一个普遍适用的标准，并没有一种能够适用于所有肿瘤细胞的筛选标志物，造成肿瘤干细胞的分选鉴定的困难，从而制约了对其的深入研究。本研究以ALDHhigh作为肿瘤干细胞的筛选标志物。

本研究结果显示，酸性微环境下，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的肿瘤干细胞比例有显著地增多，而在pH 6.8条件下培养24h ALDHhigh细胞亚群比率相比于12 h有明显下降，主要原因可能是非肿瘤干细胞的大量凋亡，造成肿瘤细胞群基数的增大；并且RNA水平和蛋白质水平的结果显示在酸性微环境下，干性相关基因的表达，如OCT4、SOX2和Lin28b都有明显的上调。Lin28b作为一个保守的RNA结合蛋白，与干性的调节与代谢都有一定的关联，可能在酸性微环境中干性调节中起着重要的作用，有待于进一步探讨。体外成球实验结果显示，酸性微环境能够促进体外成球。同时，肿瘤的迁移能力也被认为与肿瘤干细胞相关，结果显示，酸性微环境也可以显著增强人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的迁移能力。所有的结果均提示，酸性微环境有利于提高肿瘤干细胞比例，显著上调干性相关基因的表达，维持肿瘤细胞干性。

而对于酸性微环境对于干性的调节机制，本研究结果显示，酸性微环境可以激活β-catenin/TCF4信号通路以及上调转录因子HIF1α的表达，提示酸性微环境可以通过激活β-catenin/TCF4信号通路，上调转录因子HIF1α，从而实现对干性的调控。

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The tumor pH microenvironment enhance stemnessproperties via β-catenin/TCF4 activation in human breast cancer cells

CAO Feng-qi, CHEN Chong, LIU Yan, BAI Li-peng, LUO Yun-ping*

(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS，School of Basic Medicine, PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate the effects of acidic tumor microenvironment on maintaining stemness and underneath mechanism in breast cancer stem cells.MethodsHuman breast cancer cell MDA-MB-231 with either pH 6.8 or pH 7.4 medium, the percentage of ALDHhighsubpopulation, the expression of SOX2, OCT4, Lin28b and the stemness properties were detected by using FCM, Real-time PCR, Western blot, sphere test and scratch experiments. The activation of signaling pathway was also examined.ResultsAll stemness properties of MDA-MB-231 cell cultured with pH 6.8 conditional medium were increased including the percentage of ALDHhighsubpopulation(Plt;0.05), the expression of stemness gene(Plt;0.01), the capability of sphere formation(Plt;0.01) and cell mobility(Plt;0.05). These stemness properties of MDA-MB-231 cell were regulated via β-catenin/TCF4 signaling pathway that activated by pH 6.8 cultured medium.ConclusionsThe acidic tumor microenvironment increases the percentage of ALDHhighsubpopulation and enhances stemness phenotypes of breast cancer cells.

breast cancer; cancer stem cells; acidic microenvironment

2014-02-17

2014-03-12

国家重点基础研究发展计划(2013CB967202)

*通信作者(correspondingauthor)：yunpingluo@hotmail.com

1001-6325(2014)05-0622-06

R 73-35+4

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